靶向核抗原的嵌合抗原受體T細胞構建及其分泌IFN-γ功能驗證

徐忠法，甄亞男，趙春紅，王若谷，張西坤，李成軍，魯守堂，霍守俊，韓鋼，楊美家

1 山東省醫學科學院附屬醫院 山東第一醫科大學第三附屬醫院，濟南250031；2 Boston 3T Biotechnologies Inc.

近年來，嵌合抗原受體T細胞(CAR-T細胞)技術治療在急性淋巴細胞白血病等血液系統腫瘤中取得了巨大成功，但對大多數實體瘤治療效果不佳，如何突破實體瘤抑制性微環境的限制成為其治療的難點之一。CAR-T細胞的抗原結合受體經基因工程技術改造可以識別腫瘤特異性或相關性抗原，激活T細胞發揮腫瘤殺傷效應；因此，通過適當選擇CAR-T細胞靶向的抗原，有可能突破實體瘤的抑制性微環境，實現對實體瘤的殺傷作用。T細胞的激活發生在T細胞受體(TCR)與抗原提呈細胞(APC)上的抗原肽——主要組織相容性復合物(MHC)形成的免疫突觸部位[1～3]，ZAP70激酶[4]與TCR偶聯的CD3ζ在細胞內結合和磷酸化參與了T細胞的活化。除TCR之外，T細胞活化還需要共刺激配體/受體的相互作用。例如，共刺激路徑分子4-1BB可增強CD8+T細胞的增殖和存活能力，使體內細胞毒T細胞效應放大；最近發現，4-1BB共刺激路徑可能會通過活化嵌合抗原受體(CAR)防止T細胞衰竭[5]。腫瘤被認為是一種免疫系統失調性疾病，免疫系統發現腫瘤細胞時，自然殺傷細胞分泌IFN-γ可抑制腫瘤的發生發展。然而，在系統性應用IFN-γ治療腫瘤過程中發生了嚴重不良反應，臨床應用受到限制[6]。細胞壞死被認為是一種特殊形式的程序性死亡，其代謝產物可進一步觸發細胞壞死的發生[7]。實體瘤的核心經常發生細胞壞死，釋放核內抗原成分；近年來發現，針對核內抗原成分的單克隆抗體具有抗腫瘤作用，從而形成了一種新型的腫瘤治療方法即腫瘤壞死治療。在腫瘤壞死治療中，常構建細胞因子與核抗體融合蛋白，增加抗體的殺傷效應。2013年至今，我們設計了一種基因工程改造的能夠特異性識別壞死組織核小體的T細胞，與核抗原接觸后分泌IFN-γ，改變實體瘤的微環境，以達到抗腫瘤的效果。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料 慢病毒載體為美國3T生物公司專利產品；IL-2購自ProSpec-Tany TechnoGene有限公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗人球蛋白抗體購自Jackson ImmunoResearch Laboratories公司；Streptavidin PE購自BD公司。活化T細胞分選試劑盒購自ThermoFisher Scientific公司；細胞分選柱購自Miltenyi公司；淋巴細胞分離液購自Promocell公司；RPMI-1640為GIBCO公司產品；胎牛血清購自Hyclone公司。HEK293F細胞購自美國ATCC；蛋白轉運抑制劑Brefeldin A購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 核小體結合單鏈可變區(ScFv)構建 從已發表的文獻中查找篩選了6種具有核小體結合活性的單克隆抗體，包括NHS、KSUG、3H9、D6、KS3和D5。根據雜交瘤技術克隆抗體基因，構建抗體的ScFv和可結晶片段(Fc)融合基因，通過體外實驗驗證ScFv-Fc融合蛋白的核小體結合活性?；玖鞒蹋簶嫿ǖ娜诤匣蛟贖EK293F細胞中瞬時表達ScFv-Fc融合蛋白，提取融合蛋白備用。用DNA組蛋白復合物制備的核小體抗原包被96孔聚丙乙烯板，洗滌后加入融合蛋白，在特定培養基中孵育；洗滌去除培養基以及未結合的抗體，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗人球蛋白，加入顯色劑檢測融合蛋白。經體外實驗證實具有核抗原結合活性，將相關的基因亞克隆到慢病毒載體上，在ScFv基因的上游加載人IL-2基因信號序列，下游為CD8α主干以及跨膜編碼區基因，之后為CD3ζ鏈結構域編碼基因，并克隆有4-1BB的共刺激結構域，共同構建形成CAR。

1.3 CAR表達驗證 攜帶CAR編碼序列的慢病毒載體在無血清培養基中轉染HEK293F細胞，產生表達CAR的慢病毒顆粒，-80 ℃保存備用。取出慢病毒顆粒，室溫融化后，加入FuSure(美國3T生物公司)試劑，混勻后靜置5 min。將HEK293F細胞分為兩組，轉染組在體外轉導攜帶CAR的慢病毒載體，對照組轉導等量空載體。起始細胞量為1×106，連續培養；每次傳代時取10 μL，進行細胞計數并用流式細胞儀檢測CAR，實驗重復3次。檢測靶點為CAR抗原識別區，使用試劑為PE標記的山羊抗人可變區抗體。

1.4 CAR-T細胞構建 經山東省醫學科學院附屬醫院醫學倫理委員會批準，采集健康志愿者(均知情同意)血液10 mL；以分離液分離PBMC，用Pan-T細胞分離試劑(Miltenyi,德國)獲得T細胞；將細胞密度1×106單細胞懸液置于37 ℃培養箱中，隔日加入200 U/mL IL-2，培養4 d。每4×105個T細胞中加入3.6 MOI的核小體CAR表達慢病毒進行轉染，制備CAR-T細胞。

1.5 CAR-T細胞分泌IFN-γ功能觀察

1.5.1 不同抗原誘導下CAR-T細胞分泌IFN-γ功能觀察 收集轉染后的CAR-T細胞，隨機分為核小體抗原組、Brefeldin A組、聯合組。核小體抗原組加入包被核小體抗原的96孔聚苯乙烯培養板中，Brefeldin A組在含Brefeldin A的培養基中培養，聯合組在核小體抗原、Brefeldin A共同作用下培養。核小體抗原為組蛋白和DNA復合物，參照文獻制備[8]。用FITC標記的抗IFN-γ抗體標記后，通過流式細胞儀檢測IFN-γ表達細胞。

1.5.2 核小體抗原誘導下CAR-T細胞分泌IFN-γ功能動態觀察 分離人CD3+CD28+T淋巴細胞，在含IL-2的培養基中培養活化；將攜帶CAR-T的慢病毒載體轉染活化T淋巴細胞，用核小體抗原誘導T細胞表達IFN-γ；收集核小體抗原誘導0、2、48 h時的淋巴細胞，經用FITC標記的小鼠抗人IFN-γ單克隆抗體染色，以流式細胞儀檢測IFN-γ表達細胞。

2 結果

2.1 CAR的表達情況 在培養10～15 d時，轉染組表達CAR的HEK293F細胞比例達53.04%～87.17%，轉染效率可以滿足實驗要求。CAR在HEK293F細胞的表達情況，見圖1。

注：橫坐標為前向角散射光；縱坐標為PE標記的山羊抗人可變區抗體強度；R2為表達CAR的HEK293F細胞。

圖1 CAR在HEK293細胞的表達情況(流式細胞術)

2.2 CAR-T細胞分泌IFN-γ情況 不同抗原誘導下，核小體抗原組、Brefeldin A組、聯合組分泌IFN-γ的T細胞比例分別為0.028%、0.034%、3.570%。核小體抗原誘導0、48 h時檢測不到分泌IFN-γ的CAR-T細胞，2 h時分泌IFN-γ的CAR-T細胞最多。見圖2。

注：橫坐標為抗IFN-γ-FITC熒光強度；縱坐標為細胞數；R3為分泌IFN-γ的CAR-T細胞。

圖2 核小體抗原誘導不同時點分泌IFN-γ的CAR-T細胞數量變化(流式細胞術)

3 討論

本研究通過瞬時表達的ScFv-Fc片段驗證了ScFv的核小體結合功能，并進而構建具有核小體結合功能的CAR。研究發現，從抗體衍生而來的ScFv與核小體抗原親和力高，可用以構建高親和力CAR。本研究中應用的部分核小體抗體，在以往研究中已被證實與IL-2融合后可以靶向腫瘤壞死中心。Gillies等[9]構建了IL-2與靶向腫瘤壞死區的單克隆抗體NHS76的融合蛋白NHS-IL2LT，可成功抑制侵襲性神經母細胞瘤和非小細胞肺癌動物模型腫瘤的生長，實驗動物生存期延長。

本研究設計的CAR-T細胞可識別核小體抗原，并被激活分泌IFN-γ。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表面約有105個TCR表達，對于高親和力配體，幾百個TCR的參與便足夠激活CTL[10,11]。與細胞膜上的MHC抗原復合體不同，本研究構建的CAR的激活需要核小體抗原參與，CAR在細胞表面表達的數量對轉染T細胞的整體功能至關重要。本研究采用的慢病毒載體轉染效率高，轉染活化T細胞后形成的CAR-T細胞，可經抗原刺激充分激活。本研究結果顯示，轉染核小體受體的T細胞與核小體抗原共培養時會特異性表達IFN-γ，IFN-γ反過來激活抗原提呈細胞，誘導MHC Ⅱ腫瘤抗原復合物的表達[12]，增強T細胞的抗腫瘤作用。因此，我們所構建的核小體抗原識別CAR-T細胞為IFN-γ表達細胞。

本研究發現，核小體抗原誘導CAR-T細胞短暫表達IFN-γ，IFN-γ表達水平隨誘導時間延長遞減。T細胞活化后存在T細胞耗竭現象，可以通過調節基因表達來抑制T細胞活化狀態以達到免疫平衡[13]。最近，Imanishi等[14]報道自身壞死組織釋放的核酸及壞死組織復合物可誘導共刺激反應，通過抑制Th1/Th2細胞轉換關鍵因子T-bet表達，誘導T細胞向Th2細胞分化，繼而誘導GATA-3和Th2細胞因子的產生。這提示核小體可能會促進腫瘤微環境中的T細胞向Th2轉化，進而誘導腫瘤相關的巨噬細胞M2極化[15]。本研究構建的CAR-T細胞可能會消除腫瘤壞死中心積聚的大量核酸組蛋白等核小體復合物誘導的Th2免疫反應，抑制腫瘤細胞浸潤及新生血管形成，并通過在腫瘤微環境中釋放IFN-γ誘導局部免疫反應，達到抑制腫瘤的目的。

綜上所述，本研究設計的CAR-T細胞可用于腫瘤治療，能改善實體瘤的微環境。在前期臨床試驗中，實體腫瘤的CAR-T細胞治療出現了嚴重的不良反應，導致重度細胞因子風暴或結腸炎[16～20]。本研究中CAR-T細胞的靶點為實體腫瘤壞死中心積聚的核小體抗原，核酸類抗原是較為安全的靶標，針對這次抗原的單克隆抗體經臨床試驗證實安全可靠，未誘發致死性不良反應[21]。核小體抗原存在于細胞核內，不會在細胞表面表達，從而降低了脫靶效應的風險。因此，本研究設計CAR-T細胞可能不會產生類似非特異性靶向腫瘤抗原的顯著不良反應。在之后的研究中，我們將進一步確定CAR-T細胞進入腫瘤組織的數量，逆轉腫瘤微環境所需要的活化狀態，以及核小體CAR-T細胞是否對腫瘤的微轉移起到抑制作用。