復(fù)方巴戟天健骨顆粒對(duì)激素性股骨頭壞死大鼠血液狀態(tài)和骨組織形態(tài)的影響

嚴(yán)錦賢 ，倪立堅(jiān) ，宋紅梅 ，李 穎 ，王和鳴

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122）

激素性股骨頭壞死（steroid induced necrosis of femoral head,SNFH）是由于大劑量激素引起股骨頭中活性成分如脂肪細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞等死亡的病理過(guò)程［1］。有研究認(rèn)為，激素已成為非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的主因［2-3］，早期預(yù)防和治療有積極意義。福建中醫(yī)藥大學(xué)王和鳴教授長(zhǎng)期致力于研究中醫(yī)藥治療早期股骨頭缺血壞死，復(fù)方巴戟天健骨顆粒是根據(jù)其經(jīng)驗(yàn)方開(kāi)發(fā)而成的純中藥制劑（批準(zhǔn)文號(hào)：閩藥制字Z20150001），本文旨在通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討復(fù)方巴戟天健骨顆粒的作用機(jī)理，為深入研究復(fù)方巴戟天健骨顆粒治療SNFH的作用靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥品 復(fù)方巴戟天健骨顆粒（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院制劑室，批號(hào)：20171008）；健骨生丸（北京匡達(dá)制藥廠，批號(hào)：170816025）；普伐他汀鈉（上海三共制藥有限公司，批號(hào)：1709220834）；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉（美輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：H20160383）；水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20180722）；多聚甲醛（北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20170806）；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試制盒（湖南永和陽(yáng)光科技有限責(zé)任公司）；肝素（北京華英生物技術(shù)研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar雄性大鼠60只，體質(zhì)量280～320 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)碼：SCXX（滬）2017-0003，合格證編號(hào)：2015000558815。

1.3 儀器 JXN-30／26高效離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；MVIS-2015全自動(dòng)血液流變儀（重慶天海醫(yī)療設(shè)備有限公司）；7060全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；AXIOM Aristos MX型西門(mén)子X(jué)線攝影成像系統(tǒng)（德國(guó)Siemens公司）；RM2235型石蠟切片機(jī)、DM500型三目生物顯微鏡（德國(guó)Leica公司）。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及造模 將66只雄性Wistar大鼠分為正常組12只和造模組54只，后者每周1次肌肉注射MPS 21 mg／kg，連續(xù)8周，水合氯醛麻醉后X線檢查雙髖正位，造模組大鼠均有股骨頭骨質(zhì)疏松，骨小梁紊亂、中斷，顯示造模成功［4］。將造模成功大鼠取48只隨機(jī)分為模型組、顆粒組、聯(lián)合組、骨生組，各12只。

2.2 給藥 第9周開(kāi)始給藥，正常組和模型組以生理鹽水 10 mL／（kg·d）灌胃；顆粒組以復(fù)方巴戟天健骨顆粒 2.5 g／（kg·d）混懸液（按成人 60 kg 體質(zhì)量每日用量24 g計(jì)算）灌胃；聯(lián)合組以普伐他汀鈉1 mg／（kg·d）加復(fù)方巴戟天健骨顆粒混懸液2.5 g／（kg·d）灌胃；骨生組以健骨生丸混懸液 1.4 g／（kg·d）灌胃。每日1次，連續(xù)6周。

2.3 血液流變學(xué)指標(biāo)及TG、TC測(cè)定 第12周用水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血7 mL，其中5 mL用肝素抗凝后取血漿測(cè)定血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)；其余2 mL離心取血清，采用自動(dòng)生化儀三聯(lián)酶法測(cè)TG和TC。

2.4 組織病理學(xué)觀察 大鼠采血處死，取雙側(cè)股骨頭置于4%多聚甲醛中固定72 h，經(jīng)脫鈣、石蠟包埋后制成厚度為4 μm的切片，常規(guī)HE染色。于10×40倍的高倍鏡下從各觀測(cè)切片中選3個(gè)不重復(fù)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域內(nèi)選取骨陷窩50個(gè)，從中獲得空骨陷窩數(shù)，計(jì)算空骨陷窩率。3個(gè)區(qū)域共得出3個(gè)空骨陷窩率，取平均值［5］。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以SPSS 26.0處理，計(jì)量資料屬正態(tài)分布采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析法。

3 結(jié)果

3.1 5組血液流變學(xué)指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。

表1 5組血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

表1 5組血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

組別正常組模型組骨生組顆粒組聯(lián)合組n 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2血漿黏度1.2 2±0.0 7 1.8 4±0.2 8 2）1.3 5±0.1 7 3）1.3 6±0.2 9 3）1.2 3±0.2 5 4）紅細(xì)胞壓積／%4 4.4 7±3.5 8 5 1.3 0±4.6 3 1）4 5.0 9±2.4 3 3）4 4.8 9±2.0 6 3）4 5.6 2±2.8 7 3）紅細(xì)胞聚集指數(shù)2.0 1±0.3 4 2.3 8±0.2 9 1）2.1 3±0.6 1 3）2.0 8±0.2 8 3）2.0 3±0.3 1 3）

3.2 5組TG和TC水平比較 見(jiàn)表2。

表2 5組TG和TC水平比較（±s）mmoL／L

表2 5組TG和TC水平比較（±s）mmoL／L

注：與正常組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01；與骨生組比較，5） P＜0.05。

組別正常組模型組骨生組顆粒組聯(lián)合組n 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 T C 2.3 8±0.6 6 5.0 9±1.2 2 2）4.0 8±1.6 5 3）3.8 7±1.3 9 3）2.4 7±0.9 5 4）5）T G 1.1 5±0.2 8 1.8 4±0.3 4 1）1.5 5±0.3 7 3）1.4 4±0.4 8 3）1.4 6±0.6 5 3）

3.3 5組組織病理學(xué)觀察

3.3.1 5組大鼠股骨頭切片HE染色觀察 正常組骨小梁致密規(guī)則、結(jié)構(gòu)正常，偶見(jiàn)骨陷窩空虛；模型組骨小粱出現(xiàn)斷裂、間距增寬、血管數(shù)量減少，骨細(xì)胞與正常組比較減少，空骨陷窩明顯增多；各治療組股骨頭病理壞死變化較模型組減輕，關(guān)節(jié)軟骨、骨小梁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)改善。

3.3.2 5組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較 見(jiàn)表3。

4 討論

王和鳴教授認(rèn)為SNFH屬肝腎虧虛、疲血內(nèi)阻，并制定出溫陽(yáng)補(bǔ)腎、活血袪瘀的治則［6］。經(jīng)方復(fù)方巴戟天合劑以巴戟天溫陽(yáng)補(bǔ)腎，配以丹參、三七、郁金等藥活血化瘀，能有效改善SNFH患者的血液黏度，抑制血小板聚集［7］，在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出復(fù)方巴戟天健骨顆粒。作為陽(yáng)性對(duì)照的市售中成藥健骨生丸，由當(dāng)歸、三七、地龍、冰片、西紅花、珍珠、冬蟲(chóng)夏草等貴重藥材組成，臨床上用于治療瘀血阻絡(luò)、筋骨失養(yǎng)所致SNFH，應(yīng)用較為廣泛。

表3 5組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較（±s）

表3 5組大鼠股骨頭空骨陷窩率比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與骨生組比較，2） P＜0.05。

組別正常組模型組骨生組顆粒組聯(lián)合組切片數(shù)2 4 2 4 2 4 2 4 2 4空骨陷窩率／%9.3 5±1.1 7 2 5.3 4±2.4 9 1）1 8.4 3±1.8 1 1）1 7.5 9±2.4 3 1）1 2.7 8±1.5 7 1）2）

已知大劑量應(yīng)用激素能引起脂肪代謝紊亂和血液流變異常，造成SNFH［8］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和正常組相比，SNFH模型大鼠的血液流變學(xué)指標(biāo)異常，血清TG、TC上升，出現(xiàn)股骨頭骨質(zhì)疏松等表現(xiàn)，符合SNFH臨床癥狀，顯示造模成功。經(jīng)復(fù)方巴戟天健骨顆粒干預(yù)后，其血漿黏度、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均有所改善，血清TG、TC含量也有所降低。在股骨頭病理學(xué)方面，治療組股骨頭壞死情況均較模型組減輕，關(guān)節(jié)軟骨、骨小梁的結(jié)構(gòu)和形態(tài)也有較大改善。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方巴戟天健骨顆粒治療SNFH的效果與健骨生相仿，與普伐他汀聯(lián)用能更有效的降低TC水平、改善骨組織形態(tài)。

本研究存在樣本不足的問(wèn)題，后期有待提高樣本數(shù)，進(jìn)一步研究復(fù)方巴戟天健骨顆粒改善SNFH血液狀態(tài)和骨組織形態(tài)的具體作用靶點(diǎn)，深入挖掘治療SNFH患者的分子生物學(xué)機(jī)制。