高效液相色譜法測定化妝品中水楊酸的不確定度評定

張慧敏，彥培傲，徐志杰，鞠玲燕

(1.山東省海洋經濟藻類資源開發與利用工程技術協同創新中心，山東 威海 264300；2.威海海洋職業學院海洋生物與醫藥系，山東 威海 264300;3.威海出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，山東 威海 264205)

如果化妝品遭受微生物的侵入，品質將會受到嚴重影響,影響使用者健康,通常加入防腐劑抑制微生物。水楊酸為有機酸類防腐劑，具有較強的抗真菌作用[1],也有較好美容效果[W]，故水楊酸常被商家利用。但若過量使用水楊酸，會危及健康。我國《化妝品安全技術規范》(2015年版)規定水楊酸在化妝品中的限量為0.5 %，而且，除香波外，不得用于三歲以下兒童使用的產品中[3]。

《化妝品安全技術規范》(2015年版)規定水楊酸的測定方法為高效液相色譜法[3]，而且目前已報道測定水楊酸的方法也多為高效液相色譜[4-7]，液相色譜法簡便，快捷。本文對高效液相色譜法檢測化妝品中水楊酸含量的不確定度進行了評定，不確定度是測量結果的定量表征，檢測結果是否有效，主要在于其不確定度的多少[8]。在檢測過程中，因素復雜和檢測結果評定的多樣性，導致結果會帶有一定的不確定性，影響產品合格判定、司法裁定等[9-11]。為此，本文依據JJF1059.1-2012計量技術規范[12]，參照《化妝品安全技術規范》(2015年版)[3]中高效液相色譜法測定化妝品中水楊酸含量，建立數學模型，對檢測結果進行不確定度評定，希望為評定測量方法和結果的可靠性、準確性提供了科學依據。

1 儀器、試劑與材料

Aglient 1260高效液相色譜儀，配在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和二極管陣列檢測器，美國Aglient公司；Ohaus DV215CD電子分析天平(d=0.1mg)；超聲波提取儀(SB5200)：上海諾頂儀器設備有限公司。計量檢定合格的A級玻璃量器。

甲醇、磷酸，色譜純，CNW公司；水楊酸(95%)，Dr.Ehrenstorfer；乳液樣品(市售)。

2 實驗方法

2.1 環境條件

溫度(22±3)℃，相對濕度≦75%。

2.2 標準溶液的配制

20 mg/mL標準儲備液：稱取1000 mg水楊酸于50 mL棕色容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成50 mL標準儲備液，避光保存。

1000 μg/mL標準中間液A：量取0.5 mL標準儲備液于10 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成10 mL標準中間液A。

10 μg/mL標準中間液B：量取 1 mL標準中間液A于100 mL容量瓶中，用甲醇+水(75+25)溶解，配置成100 mL標準中間液B。

標準工作溶液：分別精密加入標準中間液B 500μL，標準中間液A 10,50,100,200μL置于2 mL棕色進樣瓶中，用醇+水(75+25)溶液定容至1mL，濃度依次見下表，作為S1～S5，現用現配，如表1所示，供高效液相色譜測定。

表1 標準溶液配制表

2.3 樣品前處理

取樣品0.2500 g于25 mL具塞比色管中，加入20 mL甲醇水溶液(75+25)，渦旋1min后，用超聲波提取儀提取15 min，用甲醇+水(75+25)溶液定容至25 mL，用0.45μm有機濾膜過濾，保存于2 mL棕色進樣瓶中作為待測溶液。

2.4 色譜條件

Aglient C8色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流速：1.2mL/min；柱溫：25℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：300 nm。

2.5 數學模型

式中：X——試樣中水楊酸的質量分數，單位為μg/g；

c——由標準工作曲線中得到的水楊酸含量，單位為μg/mL；

V——樣液最終體積，單位為mL；

m——最后樣液的質量，單位為g；

D——稀釋倍數。

3 結果與分析

3.1 不確定度來源分析

結合檢測流程及不確定度數學模型分析，化妝品中水楊酸含量測定的不確定度主要來源于測量重復性、標準品配制、樣品溶液、標準曲線擬合引入。

3.2 不確定度分量的量化

3.2.1 重復性測量引起的不確定度

平行制備6份樣品，分別加入標準中間液A 10μL，使得樣品加標濃度為40μg/g。6份加標樣品的水楊酸測定值分別為39.27 ,40.70 ,36.49,37.29,38.11 ,40.81 μg/g，平均為38.78 μg/g。單次測量結果的標準偏差為：

(其中n=6)

因實際進行兩次平行樣品檢測，引入的標準不確定度為：

μg/g (其中m=2)

由重復性測量引起的相對標準不確定度：

3.2.2 標準品引入的不確定度

電子天平品牌，型號為Ohaus DV215CD，1級，該天平最大允許誤差為0.1mg，引入的標準不確定度為：

實際上進行空盤和毛重兩次稱量，產生的不確定度u(m)為：

稱量1000.00mg水楊酸標準品，相對標準不確定度urel(m1)如下：

3.2.3 配制標準品引入的不確定度

使用到容量瓶的規格有100 ,50,10mL，刻度吸管1mL、移液管1mL，經檢定都是A級。

3.2.3.1 1mL刻度吸管移取0.5mL溶液引入的不確定度

(1)JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定，1mL A級刻度吸管移取0.5mL溶液，最大容量允差為±0.008mL，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：實驗室溫度波動通常為±3℃，水的膨脹系數為2.1×10-1/℃，按照矩形分布，標準不確定度為：

(3) 合成標準不確定度u(v0.5)

(4) 引入的相對標準不確定度urel(v0.5)

3.2.3.2 1mL移液管引入的不確定度

(1)校準引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定，1mL A級移液管最大容量允差為±0.007mL，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：標準參照3.2.3.1(2)，由溫度引入的標準不確定度為：

(3) 合成標準不確定度u(v1)

(4) 相對標準不確定度urel(v1)

3.2.3.3 100mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定，100mL A級容量瓶最大容量允差為±0.10mL，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標準不確定度u(v50)

(4) 相對標準不確定度urel(v100)

3.2.3.4 50mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定，50mLA級容量瓶最大容量允差為±0.05mL，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標準不確定度u(v50)

(4) 相對標準不確定度urel(v50)

3.2.3.5 10mL容量瓶引入的不確定度

(1) 校準引入的不確定度：JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規程》規定，10mL A級容量瓶最大容量允差為±0.02mL，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度

(3) 合成標準不確定度u(v10)

(4) 相對標準不確定度urel(v10)

以上過程引入的相對不確定度為：

3.2.4 樣品溶液濃度引入的不確定度

3.2.4.1 樣品稱重

天平品牌型號為Ohaus DV215CD，為1級，其最大允許誤差為0.1mg，根據矩形分布，稱量誤差引入的標準不確定度為：

實際上進行空盤和毛重兩次操作，不確定度u(m)為：

用上述天平稱取0.2500g，引入的相對標準不確定度urel(m2)為：

3.2.4.2 定容引入的不確定度

1mL定容引入的不確定度

(1)校準引入的不確定度：評定標準參照3.2.3.2(1)，標準不確定度為：

(2) 溫度引入的不確定度：

(3) 合成標準不確定度u(v1)

(4) 1mL移液管引入的相對標準不確定度urel(v2)

3.2.5 由標準曲線引入的不確定度

由五組濃度進行標準曲線擬合，如表2所示。

表2 由標準曲線引入的不確定度計算表

標準不確定度公式為：

式中： S——水楊酸溶液響應信號殘差的標準差；

b———回歸方程斜率；

m———待測物的測定次數；

n———標準溶液的測定次數；

xi———從標準曲線得出的水楊酸標準溶液的測定值；

yi———是相對于xi的測定值。

由標準曲線擬合引入的不確定度為U(curve) =0.01875233，相對不確定度為：Urel (curve)= 0.0004836

3.2.4 由方法回收率引入的不確定度

3.2.5 由分析儀器引入的不確定度

液相色譜儀安捷倫1260 (HDle-2017-12-2507612)的校準證書提供其相對標準不確定度urel (e) =0.04。

3.3 合成標準不確定度u(X)的計算

通過以上分析，該方法各分量不確定度見表3。

表3 各分量的相對標準不確定度分量表

合成相對標準不確定度為：

因此，合成不確定度為：

U(x)=0.05550×38.78=2.1523μg/g

3.4 擴展不確定度U的計算

以95%為置信概率，合成標準不確定度乘以2(k=2)，得到擴展不確定度為：

U=U(x)×k=2.1523×2=4.3046μg/g

3.5 測量不確定度的結果報告

按照《化妝品安全技術規范》(2015年版)測定乳液中水楊酸，本乳液中水楊酸測定結果表示為(38.78±4.3046) μg/g(k=2)。

4 結論

本文從標準溶液配制、標準工作溶液配制、標準曲線擬合、樣品稱量、樣品定容、重復性測試等方面對不確定度進行評定，依據《化妝品安全技術規范》(2015年版)測定化妝品中水楊酸含量時，不確定度的主要來源是樣品定容、標準品配制過程、重復性測定，儀器等。