低分子肝素的制備技術(shù)及臨床應(yīng)用進展

侯德坤，李書勝，鞏騰飛

(1.威海市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，山東 威海 264210；2.威海市食品藥品檢驗檢測中心，山東 威海 264210)

低分子肝素(Low molecular weight heparins,LMWHs)是20世紀80年代在研究未分級肝素(Unfrationated Heparin,UFH)分子構(gòu)效時發(fā)現(xiàn)的，為一組分子量不均一的硫酸多糖混合物，分子量一般為3000～8000道爾頓。英國藥典和歐洲藥典規(guī)定LMWHs的重均分子量不得大于8000道爾頓，多數(shù)產(chǎn)品平均分子量約為5000道爾頓[1]。LMWHs與UFH的性質(zhì)有所不同，這主要與其分子量分布有關(guān)。近年來隨著對LMWHs研究的不斷深入，低分子肝素的優(yōu)點不斷顯現(xiàn)出來： 抗FXa活性高，抗血栓作用強，抗FIIa活性低，出血副作用低[2-3]；在動物研究中有較為合適的利弊比率，皮下注射吸收好，半衰期長，生物利用度高[4-5]；具有較好的藥物代謝動力學(xué)的性質(zhì)，不與血小板結(jié)合，具有更為穩(wěn)定的量效關(guān)系[6-11]，引起了研究者的極大興趣。

目前，LMWHs的臨床應(yīng)用不斷擴大，成功用于防治深部靜脈血栓(Deep Venous Thrombosis,DVT)、血液透析(Hemodialysis,HD)、心臟手術(shù)體外循環(huán)(Cardiopulmonary Bypass,CPB)和肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(Heparin-Induced Thrombocytopenia,HIT)，治療播散性血管內(nèi)凝血(Diffuse Intravascular Coagulation,DIC)、靜脈炎癥綜合癥、心肌梗塞及引起的局部缺血性疾病、放療引起的血液高凝狀態(tài)等[12]。因此低分子肝素的研究與開發(fā)制備越來越受到重視，成為國內(nèi)外專家研究的熱點。

1 LMWHs制備技術(shù)的研究進展

低分子肝素的制備方法有多種，不同的制備方法得到的LMWHs生物功能和分子量也有差異(表1[13-18])。LMWHs的制備方法主要是物理降解、化學(xué)裂解和化學(xué)合成三種方法[13，19]，目前采用最多的是化學(xué)裂解法。

表1 部分LMWHs的制備方法和主要特點

1.1 物理分離法

物理分離是一種高效、綠色的分離方法，操作簡單，可控性好。其中研究較多的是超聲波法。超聲波是一種彈性機械波，利用機械性斷鍵作用和自由基氧化還原反應(yīng)來降解大分子化合物，常用于多糖的降解研究。陳勝軍等[20]利用超聲波輔助酶解法提取羅非魚眼透明質(zhì)酸，分析了超聲波功率、超聲處理時間等對透明質(zhì)酸提取的影響，得出高超聲頻率是對降解影響的主要因素。張翠玲等[21]利用超聲波輔助木瓜蛋白酶降解殼聚糖，通過正交試驗得出了超聲波功率是影響降解反應(yīng)的重要條件。

此外，物理分離法還包括層析法、凝膠色譜法、超濾法等，其中以層析分離法最為重要。凝膠過濾層析(gel filtration chromatography,GFC)是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩效應(yīng)來分離不同分子量大小LMWHs的一種方法，最常用是葡聚糖凝膠，該方法常配合其他方法使用[22]。離子交換層析法(ion-exchange chromatography,IEC) 是通過DETE-纖維素等陰離子交換劑與UFH上的負電荷離子根據(jù)交換時的結(jié)合力大小不同而將LMWHs分離出來。物理分離法制備LMWHs所用的原料一般是UFH或未分級肝素經(jīng)過裂解后的初級產(chǎn)物。通常UFH中低分子片段的含量較低，僅為1%～2%，因此利用物理分離方法制備LMWHs時產(chǎn)率較低，但物理分離不破壞LMWHs的原有結(jié)構(gòu)，生物活性較高，適用于LMWHs結(jié)構(gòu)測定和生物活性研究。

1.2 化學(xué)裂解法

化學(xué)裂解法包括亞硝酸鹽降解法[23]、過氧化氫降解法[24]、β-消除降解法[25]、臭氧解聚法、光化學(xué)解聚法等和酶降解法[26]。化學(xué)降解法具有生產(chǎn)工藝簡單、成本低、質(zhì)量易控等優(yōu)點，常用于工業(yè)生產(chǎn)。但化學(xué)降解會改變肝素的易原有結(jié)構(gòu)，有些降解反應(yīng)發(fā)生在生物活性點位，影響了肝素的抗栓活性。不同的降解反應(yīng)得到的LMWHs末端結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)物的生物功能也有所不同。

1.2.1 亞硝酸控制降解法

亞硝酸控制解聚法制備低分子肝素的生產(chǎn)工藝如圖1所示。其制備機理是在酸性環(huán)境下，亞硝酸與UFH中的N-硫酸葡糖胺反應(yīng)生成-NH2，-NH2與亞硝酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，使糖苷鍵斷裂，縮環(huán)生成2,5-脫氫甘露糖或脫氫甘露糖醇[27]。在制備過程中，亞硝酸濃度、pH 值、溫度和反應(yīng)時間等因素都會影響LMWHs 的分子量。亞硝酸濃度太低會導(dǎo)致肝素解聚不充分，濃度過高又會導(dǎo)致肝素在不適宜的位置斷裂，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。通常亞硝酸的用量依賴于LMWHs的分子量，可在0.01%～1.0%范圍內(nèi)調(diào)整[23]。反應(yīng)溫度應(yīng)控制在-5～30℃范圍內(nèi)，溫度過低，反應(yīng)溶液會發(fā)生凝固，導(dǎo)致反應(yīng)時間過長；溫度過高，則會導(dǎo)致亞硝酸分解，破壞LMWHs。溶液酸堿度與反應(yīng)時間有較大關(guān)系，反應(yīng)時間隨pH值降低逐漸減少，當(dāng)pH值 為2.5時反應(yīng)最短，因此溶液pH值應(yīng)控制在2.5左右。張萬忠等[28]以豬腸粘膜肝素鈉為原料，通過亞硝酸降解、凝膠色譜柱分離，制備了9組分子量在4000～8000 道爾頓之間的LMWHs。楊立波等[29]以肝素生產(chǎn)的副產(chǎn)品-低抗凝肝素為原料，經(jīng)亞硝酸降解制備和凝膠層析分離低分子肝素，抗凝效價為30.33U/mg，平均分子量為5200道爾頓，其氨基葡萄糖、己糖醛酸、總硫酸基的含量及特性粘度均低于低抗凝肝素，氮、磷含量及熾灼殘渣則無明顯差異。張麗萍等[30]以肝素為原料，利用亞硝酸鹽降解法，通過單因子實驗和二次旋轉(zhuǎn)回歸組合實驗，對亞硝酸降解法制備LMWH的工藝參數(shù)進行了優(yōu)化，得出在pH值2.6、反應(yīng)溫度25℃、亞硝酸濃度為0.6%、反應(yīng)時間為4h時，得到LMWHs的相對分子量小于8000道爾頓的成分含量達到89.95%。

圖1 亞硝酸解聚法制取低分子肝素工藝流程圖

1.2.2 過氧化氫降解法

過氧化氫降解法制備LMWHs的生產(chǎn)工藝如圖2所示。從反應(yīng)機理上看，過氧化氫解聚法屬于氧化解聚，因反應(yīng)產(chǎn)物無殘留，易處理，成本低，是研究較多一種解聚UFH和Hepariosan等多糖的方法。過氧化物含有化學(xué)反應(yīng)性極強的不配對電子氧自由基，它能使肝素分子中非硫酸化糖醛酸C2、C3之間的化學(xué)鍵斷裂，生成相對分子量較小的LMWHs片段[23，31]；有些還原糖需要在金屬催化劑存在或堿性條件下，才能被自由基解聚。過氧化氫解聚法主要特點是生成的LMWHs產(chǎn)物的硫酸化程度較高，實際生產(chǎn)成本低。Bianchini[24]用抗壞血酸、乙酸銅及3%的過氧化氫成功地對肝素進行降解，采用加入EDTA的方法去除殘留的銅離子，得到平均分子量為3946道爾頓的LMWHs，產(chǎn)率達到了88%。李良玉等[32]以精品肝素為原料，利用超聲波結(jié)合過氧化氫制備低分子肝素，在超聲時間76min、超聲功率405W、過氧化氫含量5.8%、超聲溫度61℃條件下得到了平均分子量為3900±50道爾頓的LMWHs。劉冬[33]利用過氧化氫降解與GPC色譜相結(jié)合的方法來制備分離LMWHs，在過氧化氫濃度2%、pH值7.0、溫度60℃條件下，反應(yīng)1 h，得到LMWH產(chǎn)物重均分子量為3773D，分子量大于8000D的組分僅占2.1%。

圖2 過氧化氫降解法制取低分子肝素工藝流程圖

1.2.3 化學(xué)β-消除降解法

β-消除降解法主要包括肝素季銨化和降解兩步處理。肝素分子中糖醛酸的酯化反應(yīng)增強了α-H的酸度，使其在溶液中與親和基團更易發(fā)生β-消除反應(yīng)；肝素分子中的季銨鹽和烷基鹵在二氯甲烷或二甲基甲酰胺存在的情況下，發(fā)生酯化反應(yīng)生成肝素酯，在堿性條件下水解生成LMWHs。利用該方法制備LWMH時，如在非水介質(zhì)中進行，降解點位不在肝素活性部位，也不發(fā)生脫硫反應(yīng)。有研究指出[34]，在氯苯和堿存在條件下，肝素的季銨鹽可加熱生成肝素芐酯，溫度為20～80℃時，肝素芐酯可形成不飽和糖醛酸。

1.2.4 臭氧解聚法及光化學(xué)解聚法

有研究發(fā)現(xiàn)臭氧既可解聚Heparosan 和普通肝素，又可消除Heparosan和LMWHs的糖醛酸殘基[35-36]。比如，臭氧分解的洛集帕林、依諾肝素及Heparosan的多糖和寡糖都消除了非還原性末端的不飽和糖醛酸。1H-NMR檢測發(fā)現(xiàn)：多糖用臭氧處理過以后，除了不飽和糖醛酸的C4-C5雙鍵被破壞以外，其他結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生改變。Higashi等[37]利用TiO2催化光化學(xué)反應(yīng)解聚Heparosan，成功將Heparosan 從15000D解聚成8000D左右。1H-NMR檢測證明，光化學(xué)解聚Heparosan是一個隨機過程，可發(fā)生在Heparosan多糖中的葡萄糖醛酸或N-乙酰胺殘基，且解聚前后結(jié)構(gòu)無變化。Higashi等[37]進一步研究利用TiO2催化光化學(xué)反應(yīng)解聚肝素，發(fā)現(xiàn)使用硼硅玻璃燈過濾器可以解聚肝素，并能顯著降低解聚過程中的造成的硫酸化基團的丟失。

1.2.5 其他制備LMWHs的化學(xué)降解法

除以上幾種化學(xué)降解方法可以制備LMWHs外，其他化學(xué)降解的方法還有次氯酸降解法[38]、高碘酸降解法[39]、γ-照射和硫酸-氯磺酸降解法[40]及酶法降解法等。高碘酸降解肝素最初是用于分析肝素化學(xué)結(jié)構(gòu)，后逐步用于LMWHs的制備。次氯酸產(chǎn)生的氧原子可使肝素中的糖苷鍵斷裂，降解生成LMWHs。采用硫酸-氯磺酸降解法制備的LMWHs分子量在2000D～9000D之間，但LMWHs的硫酸化程度較高，約為原料肝素的1.2倍。這三種制備 LMWHs 方法的機理與過氧化氫降解法制備 LMWHs 的機理相似，都是利用生成的氧自由基使肝素中非硫酸化糖醛酸的C2和C3鍵斷裂，進一步作用生成LMWHs。

酶解法是通過利用能特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的肝素酶來制備LMWHs的一種方法[41]。肝素酶是一類能降解肝素類物質(zhì)的裂解酶，最初從肝素黃桿菌(Flavobacterium heparinum)發(fā)現(xiàn)并分離，后在一些其他的微生物和真核生物中也有發(fā)現(xiàn)，比如擬桿菌屬、棒桿菌屬、芽孢桿菌屬等，但肝素黃桿菌是商品肝素酶的唯一來源。任重等[42]利用肝素黃桿菌固定化細胞裂解大分子肝素制備LMWHs，得到了相對分子質(zhì)量為5000D左右的LMWHs，活性也較好。

1.3 合成法

利用化學(xué)合成法制備LMWHs，首要步驟是合成類似于天然肝素分子的戊糖序列骨架結(jié)構(gòu)，隨后再合成其他的寡糖并在體外測試其生物活性，證明合成的肝素比普通肝素具備更好的抗血栓療效和更低的出血傾向[43]。但純化學(xué)合成法人工合成肝素，成本較高，合成步驟繁瑣，成本昂貴，產(chǎn)出率較低，不適于市場化。化學(xué)酶合成法是近些年發(fā)展的一種利用化學(xué)酶催化、化學(xué)合成相結(jié)合來制備低分子肝素的新方法，具備選擇性高、特異性強、合成產(chǎn)率高等優(yōu)點。徐詠梅等[44]報道了一種利用化學(xué)酶法合成兩種結(jié)構(gòu)確定的超低分子量肝素的方法，以簡單的二糖為原料，借助糖基轉(zhuǎn)移酶和硫酸根轉(zhuǎn)移酶催化方法，將天然葡糖胺、葡糖醛酸及硫酸根有機“結(jié)合”，合成了分子量為1778.5和1816.5道爾頓的超低分子量肝素，產(chǎn)率分別達到了45%和37%，而且這兩種超低分子量肝素具有與Arixtra肝素相當(dāng)?shù)目鼓钚约八幋鷦恿W(xué)特性。張成盈[45]以對硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷為原料，以糖基轉(zhuǎn)移酶KFiA或PmHS2的催化下，得到純度高于90%的寡糖骨架，以PAPS為硫酸基供體，有N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(NST)催化合成N-硫酸化肝素寡糖，得到兩種肝素寡糖產(chǎn)率分別為40%和80%，純度均高達92%以上。Wang 等[46]研究了化學(xué)酶法合成肝素過程中，最關(guān)鍵步驟是Heparosan 的N-去乙酰化，N-去乙酰的程度直接影響到肝素中N-乙酰/N-磺酸的比例及合成肝素的分子量。因此在化學(xué)酶合成肝素的過程中，控制好N-去乙酰化的程度能直接改進合成產(chǎn)物的性能。

綜上，不同的制備方法有各自的優(yōu)缺點。物理分離法制備LMWHs，操作過程簡單，分離純化容易，但產(chǎn)量有限，可適用于實驗室研究，不適合規(guī)模生產(chǎn)。光化學(xué)解聚法制備LMWHs，能保持解聚樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)不變，顯著降低解聚反應(yīng)時丟失硫酸基團，進而更好的保持肝素的抗凝血活性。化學(xué)酶合成法的合成過程簡單，容易控制，合成的產(chǎn)品藥理特征與動物來源相當(dāng)，利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，目前乃至今后較為理想的制備LMWHs方法是光化學(xué)解聚和化學(xué)酶合成法

2 LMWHs在臨床上的應(yīng)用

2.1 預(yù)防和治療血栓性疾病

血栓性疾病分為靜脈血栓和動脈血栓二類。靜脈血栓栓塞臨床上包括深部靜脈血栓(deep vein thrombosis,DVT)和肺栓塞(pulmonary embolism,PE)。DVT形成系血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)，屬靜脈回流障礙性疾病。因其可繼發(fā)遠期下肢深靜脈功能不全和致命性的肺栓塞、腦栓塞，被公認為是一種嚴重的術(shù)后并發(fā)癥。何俊等[47]比較了UFH和LMWHs對抑制全髖或全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后出血及靜脈血栓有效性與安全性，結(jié)果顯示LMWHs在治療中具有優(yōu)越性，療效確切。目前，以依諾肝素為代表的LMWHs已成為一種主要的靜脈血栓栓塞治療藥物，在深靜脈血栓發(fā)生率、患者的死亡率及血栓復(fù)發(fā)率等事件發(fā)生率上明顯低于肝素[48]。一項入選了1362例患者的對照研究表明，在惡性腫瘤化療中使用依諾肝素的觀察者在深靜脈血栓發(fā)生率上明顯低于對照組[49]。LMWHs 對于腰椎退行性疾病患者尤其適用[50]，對于這類患者，LMWHs的抗凝治療可以顯著降低DVT發(fā)生，具有良好的安全性。

2.2 防治心腦血管疾病

對于急性冠狀動脈綜合癥(acute coronary syndrome,ACS)患者，內(nèi)科治療藥物是阿司匹林、氯吡格雷、血小板糖蛋白IIb/IIIa受體拮抗劑，以UFH和LMWHs輔助治療。James等[51]臨床研究發(fā)現(xiàn)阿昔單抗聯(lián)合LMWHs治療ACS的副作用發(fā)生率低于阿昔單抗聯(lián)合UFH治療，二者的安全性相同。與普通肝素相比，LMWHs能更有效地減少不穩(wěn)定性冠狀動脈綜合癥病人發(fā)生死亡、心力衰竭或復(fù)發(fā)性心絞痛等嚴重后果[52-55]，這與LMWHs具有生物利用度高，血小板減少癥發(fā)生率低，可以皮下給藥優(yōu)點有關(guān)。Gurfinkel 等[56]發(fā)現(xiàn)，ACS患者皮下注射LMWHs制劑Enoxaparin與靜脈輸注UFH相比，Enoxaparin明顯具有高抗FXa活性。 此外，經(jīng)皮冠狀動脈介入(pereatoneous coronary intervention,PCI)術(shù)后使用LMWHs可降低心臟事件發(fā)生，預(yù)防PCI術(shù)后亞急性血栓形成，改善心肌缺血，且出血并發(fā)癥少。蘭丹[57]對比了低分子肝素對147例常見各類心腦血管疾病患者的臨床療效，試驗組顯效率和總有效率達到61.84%和96.05%，效果明顯好于對照組。一項研究把74例非急診介入治療患者隨機分為普通肝素對照組(125U/kg)、依諾肝素1.0mg/kg試驗組進行治療臨床試驗，結(jié)果依諾肝素組術(shù)中有效抗凝達標(biāo)率為90.6%[58]。

中老年人腦梗死發(fā)病率約占全部急性腦血管病的50%～60%，主要發(fā)病原因是動脈缺乏彈性導(dǎo)致粥樣硬化、感染性大動脈炎和多發(fā)性大動脈炎等。宋紹斌等[59]探討了低分子肝素治療腦梗死的療效及對凝血功能的影響，將112例患者隨機分為治療組和對照組，對照組采用常規(guī)治療，治療組在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上加用低分子肝素5000U，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療組總有效率達到87.5%，比對照組高12.3%，表明LMWHs治療急性腦梗死起效快，療效好。由于LMWHs對血小板及凝血酶原時間影響較小，在治療過程中未發(fā)生顱內(nèi)出血及其他臟器出血等副作用和不良反應(yīng)。

2.3 LMWHs的抗炎作用

上世紀八十年代一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，肝素除了抗凝作用外還具有抗炎作用。韓紅等[60]實驗表明LMWHs的抗炎作用一方面可能通過抗凝途徑的介導(dǎo)而發(fā)揮作用，另一方面通過下調(diào)炎癥介質(zhì)IL-8、TNFa的表達實現(xiàn)。張園[61]指出低分子肝素在子癇前期樣孕鼠模型應(yīng)用后，發(fā)現(xiàn)可以減少Th1型促炎細胞因子IL-2及INF-γ，增加抗炎細胞因子IL-10的分泌，從而發(fā)揮了抗炎作用。于萍[62]將96名患有難治性潰瘍性結(jié)腸炎的病例隨機分為2組，對照組接受常規(guī)治療，觀察組在常規(guī)方法基礎(chǔ)上加以低分子肝素治療。結(jié)果觀察組患者治療總有效率97.92%，比對照組高18.75%，表明低分子肝素在治療難治性潰瘍性結(jié)腸炎時效果明顯。Ceccarelli 等[63]建立卡拉膠誘發(fā)胸腺炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)給予LMWHs治療的胸膜炎大鼠IL-1、TNFa等促炎因子明顯減少，認為LMWHs具有明顯的抗炎作用。Civelek 等[64]則將LMWHs應(yīng)用于切口愈合大鼠模型，發(fā)現(xiàn)LMWHs可以抑制因巨噬細胞浸潤和組織水腫導(dǎo)致的早期炎癥反應(yīng)，有利于切口愈合，表明對于術(shù)后使用LMWHs不僅具有預(yù)防深靜脈血栓形成，還可能抑制切口炎癥反應(yīng)，促進手術(shù)切口愈合。

2.4 在腎臟病中的應(yīng)用

治療急慢性腎衰竭有效方法之一是血液透析(hemodialysis，HD)，但在血液透析中長期使用UFH抗凝，會引起組織中脂蛋白酶減少、血清脂活性降低，導(dǎo)致高血脂癥；還會抑制成骨細胞，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松。而采用LMWHs抗凝血液透析，輸血量少，對血小板影響小，出凝血時間恢復(fù)快，比UFH更適合有出血傾向的患者。曹磊等[65]對100例急性腎功能衰竭者在血液透析中應(yīng)用LMWHs抗凝，結(jié)果顯示研究組患者無出血、穿刺點壓迫止血時間7.43±1.25min；參照組患者有4例出血，穿刺點壓迫止血時間(12.64±1.56)min。表明低分子肝素應(yīng)用于急性腎功能衰竭患者血液透析效果明顯，可有效防止血液凝固。

2.5 其他應(yīng)用

根據(jù)文獻報道，LMWHs還對呼吸系統(tǒng)疾病[66-68]、妊娠高血壓[69-70]、腫瘤患者[71]、癌癥手術(shù)后血栓[72]、新生兒硬腫癥[73]、胎兒生長受限[74]等疾病的治療也有一定效果。

3 展望

近年來，隨著對LMWHs的藥理學(xué)越來越深入，其在臨床上的應(yīng)用范圍也日趨擴大。多項研究證明，LMWHs已取代UFH成為急性冠脈綜合征的首選抗凝藥物，但目前LMWHs給藥途徑大部分為皮下注射，且有皮下注射LMWHs的不良反應(yīng)的報道。另外LMWHs和UFH存在同樣的缺點，停藥后會出現(xiàn)血栓復(fù)發(fā)，聯(lián)合其他藥物治療已成為近年來許多學(xué)者研究的重點和熱點。此外，在LMWHs的基礎(chǔ)上制備超低分子肝素也是近年來的發(fā)展趨勢，開發(fā)和研制分布均一、具有理想分子量的低分子肝素和超低分子量肝素，發(fā)展前景廣闊。