HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細胞因子與疾病指征的相關性分析

田 龍,童 玲,叢 喆,陳 霆,薛 婧,魏 強

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,北京協和醫學院比較醫學中心,衛健委人類疾病比較醫學重點實驗室,國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室,新發再發傳染病動物模型研究北京市重點實驗室,北京 100021)

通過HAART 治療臨床上已經達到對HIV-1 感染的有效控制,但同時臨床也發現在血漿病毒載量得到有效控制的同時艾滋病感染者體內多種細胞因子的濃度仍然處于高水平狀態。 這些升高的細胞因子不僅會影響疾病的進展和治療效果,還能導致非HIV 定義性疾病(Non-AIDS-defining diseases,NAD),如心腦血管疾病、慢性肝腎與骨骼疾病以及非艾滋病定義性腫瘤[1-5]。 此外,在進行HAART 治療中依然存在不少血漿病毒載量控制效果不佳的案例[6],并且在治療失敗的案例中也觀察到了細胞因子濃度異常的現象。 針對以上問題,本研究對HAART 治療的SIVmac239 感染恒河猴血漿細胞因子在感染、治療和停藥狀態下的濃度及其與疾病指征的相關性進行了研究,以期為臨床改進治療方案降低艾滋病免疫激活的不利影響提供數據支持。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

3 只SPF 級,3 ～4 歲,4 ～5 kg,雄性中國恒河猴購自北京協爾鑫生物資源研究所[SCXK(京)2015-0011],實驗動物的飼養及操作在生物安全三級實驗室內完成[SYXK(京)2017-0027]。 實驗動物使用和管理委員會批準號為(XJ19005)。 遵循3R 原則對動物進行關懷。 實驗前進行血清學檢測,檢測結果顯示實驗猴未受到猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉錄D 型病毒(SRV-1)、猴T 淋巴細胞性I 型病毒(STLV-1)和猴B 病毒(BV)等可能對實驗造成顯著影響的病原體的感染。

1.2 主要試劑

流式抗體PerCP Mouse Anti-Human CD3 (貨號:552851),PE Mouse Anti-Human CD8 (貨號:555367) 購 自 BD 公 司； FITC anti-human CD4 Antibody (貨號:317408) 購自Biolegend 公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit (貨號: 52906) 購自QIAGEN 公司；TaqManTMRNA-to- CTTM1-Step Kit(貨號:4392938) 購自Thermo Fisher 公司；多因子檢測試劑盒Custom Premix Non-Hu Primate Cyto MAG09 (貨號:PRCYTOMAG- 40 K-09C)、TGF-β1檢測試劑盒MILLIPLEX MAP TGF?1 Magnetic Bead Single Plex Kit (貨號:TGFBMAG-64 K-01)購自Merck 公司；IP-10 Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit(貨號:EPX01 A-40284-901)、IFN-alpha Monkey ProcartaPlexTMSimplex Kit (貨號:EPX01 A-40216-901)、ProcartaPlex NHP Basic Kit (貨號:EPX010-40420-901) 購自Thermo Fisher 公司。 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(TDF)購自倍特藥業；拉米夫定片(3TC)購自上海迪泰諾藥業有限公司；克力芝(Lpv/r)購自艾伯維公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 HAART 藥物配制及動物給藥方案

將拉米夫定片(3TC)、富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(TDF)、克立芝藥片(Lpv/r)研磨成粉末。 按3TC 50 mg/kg,Lpv/r 15 mg/kg,TDF 20 mg/kg 的濃度取粉末分別溶于0.5 mL 的超純水中。 配置好的藥液分別與0.5 mL 30%的(2-羥丙基)-β-環糊精溶液混合,反復顛倒混勻至完全溶解。HAART 期間3TC 和TDF 每日肌肉注射給藥一次,Lpv/r 每日肌肉注射給藥兩次,連續給藥147 d 后停藥觀察。

1.3.2 樣本采集

分別于感染前、HAART 治療前及治療過程中的第35 天以及停藥后的第49 天采集EDTA 抗凝血。50 μL 全血用于流式檢測T 淋巴細胞亞群。 血漿用于檢測血漿病毒載量和細胞因子。

1.3.3 血漿病毒載量測定

取140 μL EDTA 抗凝血漿,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取血漿病毒RNA,利用Real-time RT-PCR 方法檢測血漿病毒載量[7]。

1.3.4 外周血T 淋巴細胞亞群檢測

取50 μL 混勻的EDTA 抗凝血依次加入PerCPCD3、FITC-CD4、PE-CD8 抗體；孵育、裂紅、洗滌過濾后。 使用Truecount 管上機檢測CD4+T 細胞絕對數及CD4+/CD8+比值[8]。

1.3.5 血漿細胞因子測定

多因子檢測試劑盒在使用前室溫平衡,按照說明書準備實驗試劑,凍存的血漿樣本解凍后渦旋混勻。 準備完成后每孔加入200 μL Assay Buffer 室溫震蕩10 min,棄去Assay Buffer；標準孔加入25 μL標準品,對照孔每孔加入25 μL 對照品,背景孔和樣品孔加入25 μL Assay Buffer；背景孔、標準孔和對照孔每孔加入25 μL matrix solution,樣品孔加入25 μL樣本后再加入25 μL Mixed Beads；貼上封口膜錫箔紙包被后置于搖床上室溫孵育2 h,洗滌兩次；每孔加入25 μL 檢測抗體置于搖床上室溫孵育1 h；加入25 μL PE 標記的鏈霉親和素,置于搖床上室溫孵育30 min,洗滌2 次；每孔加入100 μL Sheath Fluid 搖床震蕩5 min,用Bio-Plex200 Luminex 儀器檢測結果。

1.4 統計學方法

使用BD Accuri C6 Software 對流式數據進行分析, Prism Graph Pad 8 軟件進行統計分析和作圖。細胞因子與疾病指征數據進行相關性分析,P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿病毒載量檢測結果

HAART 治療前,SIVmac239 感染猴處于慢性感染階段,血漿病毒載量在105～106copies/mL 水平。HAART 治療中的第35 天,血漿病毒載量就全部轉陰。 停藥后血漿病毒載量依次反彈,第49 天達到105copies/mL 左右的水平(見圖1)。

2.2 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴外周血CD4+T 計數和CD4+/CD8+結果

圖1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿病毒載量結果Figure 1 Plasma viral load measurements in rhesus monkeys during HAART treatment

HAART 治療前實驗猴外周血CD4+T 細胞計數為每微升(699±360)個,HAART 治療中CD4+T 細胞計數升高,在治療第35 天增加到每微升(1877±767)個,HAART 治療停止以后,CD4+T 細胞數又逐漸減少,到停藥后49 d,減少到每微升(651 ±305)個。

外周血CD4+/CD8+比值在HAART 治療中有小幅度升高,停藥后的一段時間基本維持不變。 治療前實驗猴外周血CD4+/CD8+比為(1.29±0.52),HAART 治療期間外周血CD4+/CD8+細胞比值為(1.47±0.58),停藥以后在CD4+T 細胞計數下降的情況下實驗猴CD4+/CD8+比值基本保持穩定為(1.53±0.57)(見圖2)。

2.3 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴外周血細胞因子濃度的變化

感染后血漿中促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的濃度較未感染前有所升高,HAART 治療中持續升高；治療的第35 天達分別達到感染前的3.51、4.58和2.57 倍。 停藥后IL-1β、IL-6 濃度比治療過程中稍有降低,但仍高于治療前,TNF-α 則繼續升高。 在停藥的第49 天三種促炎因子的濃度分別是感染前的2.07、2.26 和4.44 倍(見圖3A)。

血漿中抑炎因子IL-10 和TGF-β1 在感染治療過程中與促炎因子有相似的變化。 感染后濃度顯著升高,HAART 治療過程中繼續升高。 治療的第35 天分別達到感染前的4.23 和4.74 倍,停藥以后IL-10 和TGF-β1 的血漿濃度緩慢下降但仍高于治療前的水平,在停藥的第49 天仍分別達到感染前的3.57 和3.31 倍(見圖3B)。

圖2 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治療前后外周血CD4+T 細胞絕對數及CD4+/CD8+比值變化Note. A, Peripheral CD4+ T cell count changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment. B, Peripheral CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment.Figure 2 Peripheral CD4+T cell count and CD4+/CD8+ ratio changes in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

趨化因子的變化趨勢更加多樣化。 IP-10 在感染后濃度量有所增加,經HAART 治療恢復到正常水平,停藥以后又有小幅度的反彈。 趨化因子MCP-1 在感染和治療中持續升高在HAART 后的第35 天達到感染前的2.79 倍,停藥以后小幅度下降。MIP-1β 是唯一在疾病過程中保持持續升高的趨化因子在停藥后第49 天達到感染前的3.22 倍,但在HAART 治療期間可以觀察到升高的趨勢放緩(見圖3C)。

抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 與促炎因子TNF-α有相似的變化趨勢,在感染和治療階段及停藥后持續升高,但IFN-α 濃度升高的幅度更大。 抗病毒因子IFN-γ 在HAART 治療的第35 天達到感染前的1.81 倍,在停藥的第49 天濃度為感染前的3.21倍。 IFN-α 在HAART 治療的第35 天濃度為感染前的2.36 倍,在停藥的第49 天達到感染前的3.38 倍(見圖3D)。

圖3 SIVmac239 感染恒河猴HAART 治療前后外周血中細胞因子濃度的變化Note. A, Changes in plasma proinflammatory cytokines IL-1β, IL-6, and TNF-α during HAART treatment and drug withdrawal. B, Changes in plasma anti-inflammatory factors IL-10 and TGF-β1 during HAART treatment and withdrawal. C, Changes in plasma chemokines IP-10, MCP-1,and MIP-1β during HAART treatment and withdrawal. D, Changes in plasma pro-apoptotic growth factor IL-2 during HAART treatment and withdrawal Change. E, Changes in plasma antiviral factors IFN-γ and IFN-α during HAART treatment and withdrawal.Figure 3 Changes in expression levels of cytokines in peripheral blood from rhesus monkeys infectedwith SIVmac239 during HAART treatment

促淋巴細胞生長因子IL-2 從感染開始到HAART 治療階段持續升高。 在治療的第35 天達到感染前的5.61 倍,停藥以后濃度稍有下降,停藥后49 天時仍為感染前的2.79 倍。

2.4 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細胞因子與疾病指征的相關性結果

促炎因子中IL-6 的血漿濃度與血漿病毒載量的相關性最好(r=-0.69, P=0.020),IL-1 β 與血漿病毒載量的相關性次之(r=-0.61, P=0.042),TNF-α 與血漿病毒載量沒有相關性(r=-0.16, P=0.346)；幾種促炎因子與CD4+T 細胞計數和CD4+/CD8+比均沒有相關性。 抑炎因子TGF-β1 的濃度與血漿病毒載量存在強的負相關性(r=-0.69, P=0.019),IL-10 與血漿病毒載量沒有顯著的相關性；兩種抑炎因子與CD4+T 細胞計數和CD4+/CD8+均沒有顯著的相關性。 趨化因子中僅IP-10 與血漿病毒載量存在強的正相關性(r=0.61, P=0.041),MCP-1 和MIP-1β 與病毒載量均沒有顯著相關性；三種趨化因子與CD4+T 細胞計數均沒有顯著的相關性,僅MIP-1β 與CD4+/CD8+比值存在強相關性(r=0.63, P=0.003)。 促淋巴細胞生長因子IL-2,抗病毒因子IFN-γ 和IFN-α 與疾病指征沒有顯著的相關性(見表1)。

3 討論

近年來,不斷優化的HAART 治療方案雖然已經能在很大范圍內控制HIV-1 感染者的血漿病毒水平,但多種細胞因子持續高濃度狀態被認為是導致多種非HIV 定義性疾病及影響艾滋病的進展和治療效果的重要因素。 很多研究也認為,促炎因子、抑炎因子、趨化因子、抗病毒因子等都對艾滋病的疾病進展有一定影響。

本研究發現,恒河猴血漿細胞因子的濃度在SIVmac239 感染后均有所升高,但在HAART 治療期間,包括促炎因子IL-1 β、IL-6、抑炎因子IL-10、TGF-β1 和促淋巴細胞生長因子IL-2 在內的大部分血漿細胞因子的濃度沒有伴隨著病毒水平的下降而降低,而是呈現出持續增高的態勢。 反而在停止HAART 治療后,逐漸下降,但下降的幅度不大,濃度基本維持在HAART 治療前的水平,仍明顯高于感染前。 促炎因子TNF-α、抗病毒因子IFN-α 和IFN-γ在感染后一直呈現持續增高的走勢。 趨化因子IP-10 在HAART 過程中下降,停藥后稍有反彈,MCP-1及MIP-1 β 自感染后基本維持不變。

表1 HAART 治療SIVmac239 感染恒河猴血漿細胞因子與疾病指征的相關性Table 1 Correlations between plasma cytokines and disease indicators in SIVmac239-infected rhesus monkeys during HAART treatment

另外,本研究還發現促炎因子IL-1 β 和IL-6、抑炎因子TGF-β1、趨化因子IP-10 的血漿濃度與血漿病毒載量存在一定的相關性。 Worley M 等人最近發現中性粒細胞可以通過介導HIV 特異性抗體依賴的ADCC 作用和抗體依賴的中性粒細胞吞噬作用清除血漿病毒顆粒[9]； IL-1 β 可以促進骨髓中性粒細胞釋放入血,IL-6 可以通過STAT3 途徑激活中性粒細胞促進其遷移能力[10]。 推測促炎因子IL-1 β和IL-6 可能通過增強中性粒細胞功能的途徑,間接產生清除血漿中病毒顆粒的作用。 TGF-β1 主要由活化的CD8+T 細胞產生,其主要功能是抑制炎癥和組織修復[11]；因此,TGF-β1 與血漿病毒載量的相關性可能與TGF-β1 本身的功能無關,而是由病毒感染后抗病毒作用的CD8+T 細胞活化增加分泌TGFβ1 的能力增強引起的。 IP-10 可以直接刺激HIV在外周血CD4+T 淋巴細胞和巨噬細胞內復制[12]。對于清除血漿病毒載量來說IL-1 β、IL-6、IP-10 這幾種細胞因子可能更具有研究的價值。 趨化因子MIP-1β 的血漿濃度與CD4+/CD8+比值相關,這個因子可能對于方便快速的檢測外周血T 淋巴細胞亞群紊亂有一定意義。

綜上所述,HAART 治療前SIVmac239 感染的恒河猴血漿細胞因子的變化趨勢與臨床病人基本一致。 HAART 治療中有部分細胞因子的變化趨勢與臨床一致,其中IL-6、TGF-β1、IP-10 的濃度無論變化趨勢還是與疾病指征的相關性都與臨床相符合[13-15]。 這為臨床進行艾滋病免疫激活造成的免疫重建失敗及其他并發癥研究提供了動物模型支持。