高效液相色譜法測定附子理中丸中6-姜辣素的含量

潘海霞，王曉琦，武紅娜

（滄州市食品藥品檢驗所，河北 滄州 061000）

附子理中丸于2009年載入《國家基本藥物目錄》，是甲類處方藥，臨床應用廣泛。其處方出自宋代的《太平惠民和劑局方》，由附子（制）、黨參、炒白術、干姜、甘草5味藥組方而成[1-5]。干姜是附子理中丸方中君藥[5]，6-姜辣素為其有效成分，具有抗胃潰瘍、止吐的藥理作用[6-8]，與附子理中丸脾胃虛寒、嘔吐泄瀉的功能相對應，可在一定程度上反映該藥的功效。6-姜辣素性質不穩定，不同產地、不同采收季節干姜中6-姜辣素含量會有所變化，生產過程中容易造成6-姜辣素成分流失[9-11]。因此選擇6-姜辣素作為附子理中丸檢驗的新指標。《中國藥典》2015年版一部為該藥的法定標準，標準中僅對干姜進行了顯微鑒別和薄層色譜鑒別，而6-姜辣素并未進行監測，故本文擬定建立高效液相色譜法（HPLC）對6-姜辣素含量進行檢驗，以期控制附子理中丸的藥品質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；CP225D型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；LC350A型超聲波處理器（魯超超聲設備有限公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

6-姜辣素對照品（批號：111833-201806，含量以99.9 %計，-20 ℃保存，中國食品藥品檢定研究院）；甘草、白術、黨參對照藥材（批號分別為：120904-201620，120925-201812，121057-201206，供鑒別用），均購自中國食品藥品檢定研究院；附子對照藥材（批號為PCS8186，供鑒別用），購自北京中科質檢生物技術有限公司；附子理中丸來自不同廠家、3種劑型共計15批次；甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水（自制），其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 588935-902 TC-C18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（30:25:45），等度洗脫；流速：0.8 ml/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：280 nm；進樣量10 μl。理論板數按6-姜辣素計算不低于5000，色譜峰與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取6-姜辣素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品水蜜丸適量，研細，取約2.2 g，精密稱定，或取小蜜丸或大蜜丸，剪碎，取約3.2 g，精密稱定；置具塞錐形瓶中，精密加入75 %乙醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）25 min，放冷，用75 %乙醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按附子理中丸（濃縮丸）處方及工藝制備缺少干姜的陰性樣品，并按2.2.2項下供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 分別取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，依據2.1項下色譜條件測定，結果見圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對照品溶液的色譜圖相應的位置上，有相同保留時間的色譜峰，而陰性對照溶液在此保留時間處無干擾。

圖1 6-姜辣素的HPLC圖譜

2.3.2 線性關系考察 取6-姜辣素對照品適量，精密稱定，加適量甲醇制成濃度分別為0.04，0.06，0.10，0.20，0.30 mg/ml的溶液，分別精密吸取上述不同濃度的對照品溶液各10 μl，按照2.1項下色譜條件測定。以峰面積（y）對濃度（x，mg/ml）進行線性回歸，得回歸方程為：y=5706.5x+22.048，相關系數r=0.9986。結果表明，6-姜辣素在0.04～0.30 mg/ml范圍內與峰面積線性關系良好。

2.3.3 溶液穩定性 將供試品溶液（2號企業，批號為180101）分別于配置后在室溫下放置0，2，4，8，12和24 h，依法測定其峰面積，結果6個檢測點6-姜辣素的峰面積的RSD為0.4 %，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 精密度試驗 取2.2.1項下對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣6次，測得6-姜辣素峰面積的RSD為0.7 %，表明儀器精密度良好。

2.3.5 重復性試驗 取同批號樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液（2號企業，批號為180101），按2.1項下色譜條件測定。結果，樣品中6-姜辣素平均含量為4.5 mg/丸，RSD為1.27 %（n=6），結果表明該方法的重復性良好。

2.3.6 回收率測定 取已知含量的樣品（2號企業，批號為180101）約3.2 g，精密稱定，分別按樣品含量的50 %，100 %，150 %加入6-姜辣素對照品，按2.2.2項下方法制備成供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，測得6-姜辣素的回收率范圍為97.75 %～102.58 %，平均回收率為99.43 %，RSD為1.5 %，結果表明加樣回收率良好。

表1 回收率試驗結果

2.4 樣品測定

取15批樣品（大蜜丸、小蜜丸、水蜜丸），按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件測定，計算6-姜辣素含量。結果見表2。由表2可見，3種劑型附子理中丸6-姜辣素含量差異較大，作為藥品的活性成分，亟待制定標準進行質量控制。

3 結論與討論

3.1 試驗結果分析

不同劑型、廠家樣品中6-姜辣素含量有明顯差異。分析原因：一是原藥材質量較差，不同產地、不同采收季節干姜中6-姜辣素含量會有所變化；二是工藝方面，水蜜丸在制丸干燥或滅菌過程中均有可能造成6-姜辣素成分流失。

3.2 提取溶劑的選擇

分別采用75 %乙醇、75 %甲醇、乙醇、甲醇、水進行提取，發現75 %甲醇提取較完全，且峰形較好，穩定性好，保留時間適中，考慮到實驗效率和效果及儀器的穩定狀態等綜合因素，確定使用75 %甲醇為溶劑。

表2 樣品測定結果

3.3 提取方式的考察

分別采用了75 %甲醇溶解，超聲15，20，40 min，振搖50，40，30 min，放置24 h，發現超聲20 min至40 min與振搖30 min提取比較完全，但隨超聲時間的延長，6-姜辣素的含量會降低，綜合考慮到實驗效率，確定為超聲20 min。

3.4 柱溫的考察

針對在含量測定中，6-姜辣素作為干姜的活性成分，但其性質不穩定。實驗中考察了柱溫（20，25，30，35 ℃）對色譜分離的影響，結果表明隨柱溫升高，供試品溶液的峰形較差，分離效果也變差，而當柱溫在 25 ℃ 時，峰形較好，分離情況較好，故建議柱溫控制在25 ℃。

3.5 方法學考察

結果表明，本實驗方法操作簡便、專屬性強、重現性好，可準確測出附子理中丸中6-姜辣素的含量，因此可用于附子理中丸及其同類藥品中6-姜辣素含量的控制。