玻璃酸二甲基硅烷醇復(fù)合物對鼻黏膜上皮細胞的作用研究

劉 霞，張小剛，郭新艷，陳建英, ，劉 飛，凌沛學(xué),

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 博士后科研工作站 山東省生物藥物重點實驗室 山東省多糖類藥物工程實驗室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實驗室，山東 濟南 250101；2. 山東福瑞達醫(yī)藥集團有限公司 山東省黏膜與皮膚給藥技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250101 ）

近年，日益嚴重的空氣污染已成為我國大部分地區(qū)面臨的嚴重環(huán)境問題。研究發(fā)現(xiàn)空氣污染物中主要含二氧化硫、氮氧化物、煙堿和強致癌性的苯并芘、亞硝胺等有害成分[1]。流行病學(xué)研究表明空氣污染可誘發(fā)鼻腔炎性疾病，空氣污染嚴重的地區(qū)人群中流鼻涕、鼻子癢干、鼻塞、流鼻血、打噴嚏等癥狀發(fā)生率均高于空氣質(zhì)量良好的地區(qū)[2-3]。鼻腔黏膜上皮細胞作為鼻腔直接與空氣接觸的第一道天然防線，具有活躍的分泌功能，在外界理化因素的刺激下，釋放細胞因子作用于其他細胞，在鼻腔、鼻竇的慢性炎癥、損傷修復(fù)及重塑過程中發(fā)揮重要作用。空氣污染物易使呼吸間鼻腔黏膜產(chǎn)生不適，適時對鼻腔進行清洗，能在滋潤鼻腔黏膜的同時，起到抗菌作用。

玻璃酸（hyalouronic acid，HA）又名透明質(zhì)酸，是由D-葡糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基葡糖（GlcNAc）雙糖單位通過交替的β-1, 3和β-1, 4糖苷鍵連接而成的線性高分子酸性黏多糖。HA是構(gòu)成皮膚細胞外基質(zhì)的主要成分之一，具有良好的吸濕性，能攜帶自身500倍以上的水分，是目前公認的最佳天然保濕因子，廣泛應(yīng)用于眼科、骨科、保健品、化妝品等領(lǐng)域[4]。玻璃酸二甲基硅烷醇復(fù)合物（dimethyl silanol hyaluronate，DSHA）是HA的二甲基硅烷醇衍生物，研究表明DSHA無皮膚刺激性，無細胞毒性，與HA相比，保濕性更佳，研究發(fā)現(xiàn)DSHA還具有促進皮膚角質(zhì)細胞增殖的作用[5]。目前市售鼻腔護理產(chǎn)品多以高滲或等滲鹽水和海水為主要成分，主要作用是對鼻腔的清洗。然而，日常使用鹽水或海水對鼻腔進行清洗后，大部分鼻腔黏膜正常分泌的黏液被沖洗液帶走，空氣中的有害顆粒、霧霾成分和有害氣體直接接觸鼻腔黏膜表面，刺激黏膜引起鼻腔干癢癥狀，癥狀的解除依賴于新的黏液分泌。前期我們在研究中發(fā)現(xiàn) DSHA具有高效保濕、潤滑和減少黏濕感的優(yōu)點，與黏膜組織有較好的親和性，用于鼻腔沖洗液可在黏膜和纖毛表面形成較薄的液層，起到隔離和潤濕功能，可有效減輕鹽水或海水沖洗之后造成的鼻腔干癢癥狀。但含DSHA的鼻噴劑的細胞毒性及是否具有抑制空氣污染物對鼻黏膜上皮細胞損傷的保護作用，目前尚不清楚。

本研究采用噻唑藍（MTT）法對DSHA原料藥及含DSHA的鼻噴劑在鼻黏膜上皮細胞的細胞毒性進行研究，并以苯并芘（BAP）刺激離體培養(yǎng)的鼻黏膜上皮細胞，模擬霧霾對鼻黏膜的損傷，對DSHA的保護作用進行研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

倒置相差顯微鏡（Nikon）：酶標儀（Tecan，Infinite M200 PRO）。

1.2 試劑

DSHA藥用原料，含DSHA的鼻噴劑，不含DSHA的鼻噴劑對照（山東福瑞達生物工程有限公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco）；胎牛血清（FBS，Gibco）；青、鏈霉素（BI）；胰蛋白酶（Gibco）；MTT（Sigma）；二甲基亞砜（DMSO，上海生工）；BAP（Sigma）；腫瘤壞死因子α（TNF-α），白介素1（IL-1），IL-8檢測試劑盒（南京建成）；實驗用水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 鼻黏膜上皮細胞的分離

取新西蘭大白兔的鼻黏膜，用含雙抗（100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素）、4 ℃預(yù)冷的PBS溶液對組織進行沖洗，將菲薄的黏膜層從黏膜下組織小心地分離下來（略呈黃色的一面是上皮層），黏膜剪碎后加入0.1 % I型膠原酶消化（37 ℃孵育30 min），消化后在上述有黏膜塊的酶溶液內(nèi)直接加入等量的0.25 %胰蛋白酶，輕輕吹打5 min，移除黏膜塊，細胞懸液離心（1200 r/min，5 min），棄上清，細胞沉淀中加入適量含10 %FBS的培養(yǎng)基，吹打均勻后接種于細胞培養(yǎng)瓶。

2.2 細胞培養(yǎng)

兔鼻黏膜上皮細胞加含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于25 cm2培養(yǎng)瓶，于5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

2.3 MTT法檢測DSHA的細胞毒性

取對數(shù)生長期的兔鼻黏膜上皮細胞，以1×105個/ml的密度，接種于96孔板，每孔100 μl，置5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，棄掉96孔板中培養(yǎng)基，試驗組分別加入100 μl供試液。試驗組設(shè)正常組（加入新鮮培養(yǎng)基）、陰性對照組（加入生理鹽水）、鹽水鼻腔噴霧劑組（分別含0.001 %，0.002 %，0.003 %，0.004 %，0.005 %DSHA）、黏膜用DSHA原料組（分別含0.002 %，0.004 %，0.008 %，0.01 %，0.02 %，0.03 %，0.04 %，0.05 %DSHA），每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl ，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入100 μl DMSO，搖床上低速振蕩10 min。震蕩平板，以酶標儀測定各孔490 nm處的OD值，計算細胞相對增殖率。

2.4 DSHA對BAP引起的細胞損傷的保護作用檢測

多環(huán)芳烴是一類常見的大氣中的有毒物質(zhì)，BAP是多環(huán)芳烴中毒性最大的一種強致癌物質(zhì)，可對人類內(nèi)臟器官、神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，還會造成DNA的損傷，誘發(fā)細胞癌變[6-8]。BAP是最主要的大氣污染監(jiān)測對象之一。本研究以5 μg/ml BAP造模，模擬大氣污染對鼻黏膜細胞的損傷。取對數(shù)生長期的兔鼻黏膜細胞，以1×105個/ml的密度接種于96孔板，置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后加藥處理各測試組細胞。細胞分組：（1）正常組：每孔加入完全培養(yǎng)液（含10 %FBS）100 μl；（2）對照組：每孔加入含DMSO（最終質(zhì)量濃度0.2 %）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μl；（3）BAP組：每孔加入含BAP（最終質(zhì)量濃度5 μg/ml）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100μl；（4）BAP+DSHA組：每孔加入含BAP（最終質(zhì)量濃度5 μg/ml）和 DSHA（最終質(zhì)量濃度0.001 %）的基礎(chǔ)培養(yǎng)液100 μl。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，利用MTT法檢測細胞存活率的變化。

2.5 細胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8含量的測定

提取細胞培養(yǎng)上清，4 ℃，12000×g離心15 min，收集上清于冰上預(yù)冷的EP管中，分別采用TNF-α、IL-1和IL-8 ELISA檢測試劑盒，參照試劑盒說明書，檢測各組細胞中TNF-α、IL-1和IL-8含量。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗數(shù)據(jù)來自3次獨立的重復(fù)實驗，實驗采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析進行多組間差異分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DSHA對兔鼻黏膜細胞的細胞毒性

細胞毒性結(jié)果見表1。由表1可見，DSHA原料在0.002 %～0.05 %的濃度范圍內(nèi)、鹽水鼻噴霧劑在0.001 %～0.005 %的濃度范圍內(nèi)，細胞存活率均＞99 %，判定為無細胞毒性。

表1 DSHA對各組細胞存活率的影響

3.2 DSHA抑制BAP引起的鼻黏膜細胞的損傷

結(jié)果見圖1。由圖1可見，與正常組相比，對照組細胞存活率（60.59 %±1.74 %）顯著降低（P＜0.01）；與對照組相比，BAP處理組的細胞存活率顯著降低至48.18 %±1.63 % （P＜0.01），DSHA可顯著逆轉(zhuǎn)這一趨勢（P＜0.01），細胞存活率上升至62.14 %±1.87 %。這表明DSHA可顯著抑制BAP引起的鼻黏膜細胞存活率的下降。

圖1 DSHA對BAP引起的鼻黏膜細胞損傷的保護

3.3 DSHA對鼻黏膜上皮細胞分泌的炎性因子的影響

研究表明，TNF-α、IL-1、IL-8作為促炎細胞因子，可趨化炎癥細胞并釋放炎性遞質(zhì)，在遲發(fā)超敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[2,9]，在本研究中，我們對上述3個關(guān)鍵細胞因子進行了研究，結(jié)果見表2。培養(yǎng)24 h后, 對照組與正常組相比，TNF-α、IL-1、IL-8 3種炎性因子的含量均顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；BAP加入后，細胞中上述3種炎癥因子的含量均有不同程度的提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜ 0.01）；DSHA可顯著抑制BAP引起的TNF-α、IL-1、IL-8的含量升高（P＜0.05，P＜0.01）。綜上所述，含DSHA的鼻噴劑對BAP引起的鼻黏膜細胞存活率的下降有顯著抑制作用，且其發(fā)揮作用機制與抑制細胞因子TNF-α、IL-1、IL-8的高表達有關(guān)。

4 討論

隨著大氣污染的日益加重，患有鼻腔疾病的患者不斷增多，鼻腔護理相關(guān)制劑的開發(fā)成為近年研究人員關(guān)注的熱點。鼻腔疾病除了用藥，鼻腔清洗液的使用對于緩解鼻腔不適也多有益處。本研究發(fā)現(xiàn)，含DSHA的鼻噴劑及原料藥對鼻黏膜上皮細胞無細胞毒性，且可有效抑制BAP引起的鼻黏膜上皮細胞存活率的下降，降低炎性因子TNF-α、IL-1、IL-8的水平。這為DSHA開發(fā)為鼻腔護理用品或醫(yī)療器械產(chǎn)品提供了理論基礎(chǔ)。

表2 細胞上清中TNF-α、IL-1、IL-8水平的變化