分子對接技術結合LC-MS/MS篩選半夏厚樸湯抗PDE4有效成分

劉作龍，咸瑞卿，付 杰，生立嵩

（1. 山東豐金生物醫藥有限公司 ，山東 煙臺 264100；2. 山東省食品藥品檢驗研究院，山東 濟南 250000；3.華熙生物科技股份有限公司，山東 濟南 250101；4. 山東省中醫藥研究院，山東 濟南 250014）

半夏厚樸方來源于漢代張仲景《金匱要略》，主要由半夏、厚樸、茯苓、生姜、蘇葉組成。半夏厚樸湯有行氣散結，降逆化痰之功效。主治梅核氣，臨床常用于治療癔病、胃神經官能癥、慢性咽炎、慢性支氣管炎、食道痙攣等屬氣滯痰阻者。當代研究以治療梅核氣[1]，反流性食管炎[2]，慢性咽喉炎等為主，有臨床研究將半夏厚樸湯用于治療慢性阻塞性肺病（COPD）[3]。近年，較多研究指出半夏厚樸湯可能對抑郁癥有效[4-5]。磷酸二酯酶4（PDE4）靶點是抗抑郁治療的重要靶點[6]，PDE4抑制劑羅氟司特通過抗炎作用治療COPD[7]，目前也有研究發現該藥有較好的抗抑郁作用[8-9]。這與半夏厚樸湯治療梅核氣兼有抗抑郁效果的作用極為相似，提示我們半夏厚樸湯可能存在抗PDE4的成分（組）。因此，本研究選擇PDE4靶點蛋白晶體結構，采用國家藥學科學數據中心天然小分子藥物數據庫[10]，中藥系統藥理數據庫和分析平臺（TCMSP）[11]，及文獻報道的半夏等6味藥物中提取的化合物，使用Autodock分子對接軟件，篩選對接結果理想的化合物分子。對不同方法提取的半夏厚樸湯樣品進行高分辨質譜掃描，對上述對接結果表現較好的化合物進行比對，并比較潛在有效化合物在不同提取方法下的含量差異。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

DNA503型電子分析天平（南京伯尼塔電子科技）；KDM型控溫電熱套（鄄城華魯電熱儀器）；Q Exactive Plus 高效液相色譜-質譜聯用儀（美國賽默飛公司）。

1.2 試藥

半夏、厚樸、茯苓、生姜、紫蘇葉（購自濟南建聯中藥店），乙醇（分析純，國藥集團）；乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 軟件及數據庫

國家藥學科學數據中心天然小分子藥物數據庫，中國知網醫藥衛生數據庫，TCMSP，Autodock1.5.6分子對接軟件，Autodock Vina 虛擬篩選軟件，Discovery Studio2016版（單機版）。

2 方法與結果

2.1 虛擬篩選

2.1.1 化合物的收集與處理 查詢TCMSP[10]，中國知網醫藥衛生數據庫等，收集上述5味中藥材公開報道的化合物，共得到1028個小分子化合物，采用Autodock中的raccoon模塊處理小分子，優化構象，生成pdbqt文件，作為小分子化合物庫。

2.1.2 分子對接與虛擬篩選 利用文獻[12]報道的PDE4蛋白晶體結構（PDB ID：3W5E），按文獻[13]報道方法，在Autodock1.5.6軟件中處理蛋白質晶體結構，去水加氫加電荷后保存為pdbqt文件。利用蛋白質晶體中自帶的抑制劑作為結合位置，設置grid box center x=19.999，y=15.795，z=-7.07；grid box size x=24， y=26，z=24。Docking算法采用local search以提高計算速度。將小分子化合物庫與PDE4蛋白在Autodock vina中進行分子對接，每味藥材所收集的小分子中，取計算結合能最低的2 %作為潛在有效化合物。

2.2 樣品提取

按藥材粉碎程度和提取溶劑不同設計提取方案，將藥材分別粉碎為40目細粉和簡單破碎，分別采用95 %乙醇，50 %乙醇及水3種溶劑提取，藥材溶劑比為1:10（w:v），回流提取2次，每次2 h。合并提取液，混合均勻后取適量，加甲醇稀釋10倍，作為供試品。具體實驗設計見表1。

表1 樣品提取方法

2.3 超高效液相色譜-串聯四級桿飛行時間質譜儀聯用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）檢測

色譜條件為：色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm）；流動相為0.5 %甲酸溶液（A）-甲醇（B）；梯度洗脫，條件見表2，流速0.3 ml/min；質譜條件：掃描范圍：80～1200m/z；In-source CID：0.0 ev；分辨率：70 000；AGC Target：1e6；Maximum IT：100 ms； 流速0.3 ml/min；柱溫30 ℃；正離子檢測，進樣量3 μl。

表2 梯度洗脫程序

2.4 分子對接與虛擬篩選結果

對蛋白質晶體中自帶的抑制劑分子進行分子對接計算，結合能為-10.9 kcal/mol，說明對接方法可靠，可用于虛擬篩選。經分子對接計算，共篩選得到25個優選化合物，結合能與結構式見表3。結合能最低的化合物前3名用Discovery Studio單機版計算與蛋白質作用力（2D），示意圖見圖1～3。

表3 優選化合物（結合能最低的前2 %）

半夏 -9.4 b a i c a l a i n半夏 -9.2 c a m p e s t e r o l半夏 -9.2 c o n i f e r i n半夏 -9.1 c y c l o(L-t y r o s y l-L-p h e n y l a l a n y l)生姜 -8.8 g i n g e r e n o n e-C生姜 -8.8 h e p t a p h y l l i n e生姜 -8.7 g i n g e r e n o n e-a生姜 -9.3 m u u r o l e n e生姜 -9.3 α-b u l n e s e n e生姜 -8.9 c l i o n a s t e r o l生姜 -8.9 γ-c a d i n e n e生姜 -8.9 (-)-c a l a m e n e n e茯苓 -8.5 h e d e r a g e n i n

圖1 Cavidine與蛋白的作用力模式圖

圖2 Cosmetin與蛋白的作用力模式圖

圖3 Isoequilenin與蛋白的作用力模式圖

2.5 UPLC-Q-TOF-MS/MS檢測結果

對照質譜數據庫NIST及文獻，本實驗共比對5個化合物，分別是黃芩素（baicalein），野黃芩素（scutellarein），四羥基異黃酮（orobol），木犀草素（luteolin），芹菜素（apigenin） ，主要成分UPLC-Q-TOF-MS/MS分析結果見表4。峰面積結果見表5。由表5可見，黃芩素、野黃芩素、木犀草素、四羥基異黃酮4種成分以50 %乙醇提取含量最高，芹菜素以95 %乙醇提取含量最高。粉碎樣品成分含量普遍較破碎樣品為高，但成分含量主要受提取溶劑影響。

表4 主要成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析結果

表5 主要成分峰面積

3 討論

篩選半夏厚樸湯方中各藥材中25種化合物，結合能大部分低于-9.0 kcal/mol，結合能最低的化合物cavidine（-10.7 kcal/mol）與蛋白質晶體自帶抑制劑的結合能（-10.9 kcal/mol）接近，表明這些化合物可能與PDE4酶有較好的結合作用。提示半夏厚樸湯可能通過抑制PDE4作用發揮抗抑郁癥作用。

通過LC-MS聯用檢測，從不同方法提取的半夏厚樸湯中檢測到5個潛在有效成分。這5個成分均為黃酮類成分，其他類成分未檢出，提示所用的LC-MS檢測條件還有待進一步優化。在篩選的有效成分中，部分成分為揮發性成分，因而采用LC-MS未能檢測到；也有部分化合物可能在提取過程中損耗，也提示半夏厚樸湯方可能需在特定的提取條件下才能更好地發揮抗PDE4作用。

在不同提取方法下，這5種成分含量差異較大，黃芩素、野黃芩素、木犀草素、四羥基異黃酮4種成分以50 %乙醇提取含量最高，芹菜素以95 %乙醇提取含量最高，成分含量受溶劑的作用影響較大，而藥材粉碎程度影響不大。表明不同提取方法可能對半夏厚樸湯治療抑郁癥作用有較大影響。后續還需在綜合有效成分含量的基礎上，對半夏厚樸湯的提取制劑工藝進行進一步優化驗證。