不同產地辣木葉HPLC指紋圖譜研究

（廣州澤力醫藥科技有限公司，廣東 廣州 510663）

辣木（Moringa oleiferaLam.），又稱奇樹、鼓槌樹，是辣木科辣木屬（Moringa）的一種木本植物，原產印度及非洲，廣泛種植于亞洲和非洲熱帶和亞熱帶地區[1-2]。目前我國海南、云南、福建、貴州和廣東等地均有種植[3]，2012年被國家衛生部批準為新資源食品。辣木的根、葉和嫩果可食用[4]；種子可榨油[5]。相關研究表明，辣木有降糖降脂[6-8]、通便解酒[9-10]、鎮靜止痛[11]、抗氧化抗衰老[12-15]等功效，對預防及緩解人體各種慢性病均有一定功效，有必要對其質量標準及化學成分進行深入研究。

目前辣木葉質量標準多以營養成分礦質元素含量高低為指標，忽略了具有藥效作用的活性成分變化，僅有金玲等[16]、曾明瑩等[17]、許琳等[18]對辣木葉液相指紋圖譜進行初步研究。本實驗基于高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜的優點及辣木葉相關質量研究，收集廣東、云南及福建區域的辣木葉，分析比較其HPLC指紋圖譜特征，為不同產地辣木葉質量特征的確定、質量控制標準的完善及原料質量可追溯系統的構建提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilengt1100系列高效液相色譜儀（包括DAD陣列檢測器，美國Agilent 公司）；Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；DV215CD 型電子天平（美國奧豪斯公司）；KQ3200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW135 型中藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

沒食子酸對照品（成都普思生物科技有限公司，批號P80380030）；異槲皮苷對照品（北京儀化通標科技有限公司，批號170526-0373）；乙腈，甲醇（美國Fisher 公司，色譜純），磷酸（成都市科龍化工試劑廠，分析純），超級純水。9批辣木葉產地來源見表1。

表1 9批辣木葉原材產地來源

2 方法與結果

2.1 色譜條件優化

2.1.1 檢測波長的選擇 在紫外檢測器下進行全波長掃描，全波長掃描圖顯示在230 nm下出現的色譜峰較多，且大部分樣品的色譜峰有較強的吸收。根據紫外檢測結果，選擇230，254，280，320，360 nm 5個波長進行HPLC分析，見圖1。綜合紫外全波長檢測結果及HPLC分析結果，選擇230 nm作為辣木葉HPLC指紋圖譜的檢測波長。

圖1 5個不同波長的色譜圖

2.1.2 流動相的選擇 辣木葉藥材中物質成分復雜，為提高色譜峰分離度，分別考察流動相系統：乙腈-水（加酸）、甲醇-水（加酸），洗脫梯度設置相同，結果見圖2。甲醇-水（加酸）系統所得的譜圖信息較豐富，因此選擇流動相甲醇-水（加酸）。

圖2 流動相系統選擇

2.1.3 色譜柱的選擇 為優選色譜柱，本實驗分別考察迪馬Diamonsil C18和島津Inertsil C18色譜柱。結果見圖3，Diamonsil C18色譜柱分析效果更優。

圖3 色譜柱的選擇

2.1.4 洗脫梯度的選擇 為保證譜圖各成分分離良好，故對色譜梯度進行優化。譜圖比較發現，流動相為甲醇-0.05 %磷酸溶液，梯度洗脫條件見表2，分離效果和色譜峰形較好（見圖4中6號色譜圖）。

表2 梯度洗脫程序

圖4 梯度優化色譜圖

2.1.5 色譜條件的確定 根據以上優化結果，確定最佳的色譜條件為：色譜柱：迪馬Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A），0.05 %磷酸（B）；梯度洗脫（0～20 min，5 %～10 % A；20～40 min，10 %～28 % A；40～65 min，28 %～50 %；65～75 min，50 %～100 % A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸對照品4.0 mg，異槲皮苷對照品2.3 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 ml量瓶，搖勻，即得質量濃度為0.004 g/L沒食子酸對照品溶液和0.230 g/L異槲皮苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取辣木葉樣品適量，粉碎，過1.2 mm篩網，稱取4.0 g，精密稱定，置入50 ml具塞錐形瓶，精密加入純水20 ml，稱定質量，超聲提取30 min（功率500 W，頻率53 kHz），補足減失的質量，過濾（中性濾紙），搖勻，濾液于0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 指紋圖譜的方法學考察

2.3.1 精密度試驗 依法制備供試品溶液，按2.1.5項下色譜條件，連續進樣6次，測定，以沒食子酸峰（4號峰）為參照峰，分別測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于3.0 %，相對峰面積的RSD均小于1.5 %，且各譜圖相似度均在0.99以上，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 稱取同一辣木葉藥材細碎品（批號為YF20190401）6份，依法制備供試液，按2.1.5項下色譜條件進樣分析，以沒食子酸峰（4號峰）為參照峰，分別測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于2.0 %，相對峰面積的RSD均小于2.5 %，且各譜圖相似度均在0.98以上，表明該方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 依法制備供試品溶液，按2.1.5項下色譜條件，分別于0，2，4，6，12，24 h時進樣測定，以沒食子酸峰（4號峰）為參照峰，分別測得各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均＜2.0 %，相對峰面積的RSD均＜2.0 %，且各譜圖相似度均在0.97以上，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.4 辣木葉指紋圖譜的建立及共有峰的指認

取9批不同產地的辣木葉細碎品適量，按2.2.2項下制備各供試品溶液，按2.1.5項下色譜條件進樣分析，記錄各產地辣木葉230 nm處的色譜圖。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）軟件生成對照指紋圖譜色譜圖，標定共有峰15個，見圖5，6。精密吸取對照品進行測定，通過與對照品保留時間比對，指認指紋圖譜15個共有峰中的沒食子酸（4號峰），異槲皮苷（11號峰）。

圖5 9批辣木葉藥材的指紋圖譜疊加圖

圖6 辣木葉藥材指紋圖譜共有峰及特征峰標定

2.5 9批辣木葉原材相似度評價

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”對藥材樣品指紋圖譜進行相似度評價，將9批樣品色譜圖與對照指紋圖譜比較，其中沒食子酸峰（4號峰）峰形和分離度都較好，故選擇作為參照峰，計算各共有峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積，具體結果見表3～5。

結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均小于2.0 %，各共有峰的相對峰面積差別顯著，表明不同產地辣木葉藥材化學成分在種類無太大差別，但含量存在較大差異。表5結果表明，廣東、云南、福建所采集的辣木葉原材相似度在0.6～0.9，化學成分含量呈區域性顯著差別，結果與表4結果一致。不同區域辣木葉原材化學成分含量差異較大，原因可能與辣木葉原材中成分含量受地區氣候、采收期及加工方式等因素有關。

3 討論

本研究首次對廣東地區、云南地區、福建地區采集的辣木葉藥材液相指紋圖譜研究，經方法學考察，精密度、穩定性、重復性、準確度良好，多批辣木葉的成分種類差別小，但各共有峰峰面積相差較大，表明本實驗收集的不同區域辣木葉成分含量有較大差異，且同一區域的辣木葉成分種類基本吻合。本實驗建立的液相指紋圖譜質量標準可準確反映不同區域辣木葉成分種類及含量的差別，對辣木葉原料的質量控制及相關辣木葉產品的開發提供高水平的質控標準，同時也為辣木葉原料的篩選提供科學的評價方式。

表3 9批辣木葉指紋圖譜共有峰相對保留時間

表4 9批辣木葉指紋圖譜共有峰相對峰面積

表5 9批辣木葉藥材相似度分析