響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取六神曲中總黃酮的工藝研究*

河北中醫(yī)學(xué)院 河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心

郭 梅 木盼盼 安 琪 薛紫鯨 郭 龍 鄭玉光 張 丹 (石家莊 050200)

提要 目的：研究響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取六神曲中總黃酮的工藝條件。方法：以六神曲為原料，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，通過單因素法考察提取時(shí)間、料液比和溶劑濃度對六神曲提取效果的影響。根據(jù)Box-Behnken原理，采用3因素3 水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果：溶劑濃度對六神曲的提取效果影響最大，其次是提取時(shí)間和藥材重量。響應(yīng)面法優(yōu)化得六神曲中總黃酮超聲提取工藝的最適條件為：超聲時(shí)間28 min、乙醇濃度 77%、料液比13 g : 30 mL，在此條件下六神曲中總黃酮提取率為0.046%，模型預(yù)測值為0.049%，二者相對偏差小于5%。結(jié)論：方程擬合良好，說明響應(yīng)面優(yōu)化所得的六神曲提取工藝穩(wěn)定、可行。

六神曲MassaMedicataFermentata，又名神曲，被譽(yù)為中藥第一曲，是一味傳統(tǒng)曲劑類中藥。由赤小豆、苦杏仁、青蒿、蒼耳草、辣蓼配以帶麩面粉按一定比例混合自然發(fā)酵制成，[1]具有健脾開胃并有發(fā)散作用。[2]由于炮制人員的水平和經(jīng)驗(yàn)參差不齊，使不同產(chǎn)地和不同批次的六神曲的質(zhì)量存在很大差異。目前神曲的鑒別方法主要通過其外觀性狀、粉末顯微特征的比較分析，缺乏量化的質(zhì)量評價(jià)方法，[3]且《中國藥典》2015版未收載。關(guān)于六神曲化學(xué)成分的研究報(bào)道比較少，其主要含有酵母菌、酶類、維生素B復(fù)合體、麥角固醇、揮發(fā)油、苷類、黃酮類成分等。[4]黃酮類化合物是植物界廣泛存在的一種天然活性成分，具有血管擴(kuò)張、抗氧化和抗癌等作用。目前，六神曲質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究多集中在黃酮類成分，[5]辣蓼和蒼耳中含有蘆丁和槲皮素，均具有抗炎止血和抑菌的功效，[6-7]與六神曲的功效具有一定的相關(guān)性。

響應(yīng)面法起源于20世紀(jì)70年代，主要應(yīng)用于食品藥品工業(yè)。[8]近年來，將此法應(yīng)用于中藥提取工藝的優(yōu)化成為一種趨勢。[9-13]其通過模擬多個(gè)變量間的函數(shù)關(guān)系，建立因素與響應(yīng)值之間的多元二次回歸方程，得到最佳提取條件。故本實(shí)驗(yàn)利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化六神曲中總黃酮超聲輔助提取工藝的最佳條件，為六神曲的深入研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

紫外可見分光光度計(jì)(UV-2600，島津儀器有限公司)；KQ-300VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。六神曲(安國藥材市場)，蘆丁對照品(成都昂賽思生物科技有限公司，批號：170426)；無水乙醇(分析純AR，天津歐博凱化工有限公司)；水為自制一級超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備 六神曲粉碎，過40目篩，精密稱定六神曲粉10 g，置于100 mL的錐形瓶中，精密加入30 mL適宜濃度的乙醇，在一定條件下超聲提取，搖勻，13 000 r/min離心10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定蘆丁10 mg，置于25 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至25 mL，即得蘆丁母液。

2.3 六神曲中總黃酮含量測定 采用NaNO2-Al(NO3)3顯色法，取提取液3 mL加至25 mL容量瓶中，然后再加入1 mL的NaNO2(5%)溶液搖勻，室溫下靜置6 min，使其充分反應(yīng)；加入1 mL的Al(NO3)3(10%)溶液搖勻，室溫下靜置6 min，使其充分反應(yīng)；加入10 mL 1 mol/L的NaOH溶液，加入適宜濃度的乙醇定容至25 mL，靜置15 min，使其充分反應(yīng)。用紫外-分光光度計(jì)在500 nm處測定吸光度。

2.4 總黃酮提取率 總黃酮提取率(%)= C×V×N/(1 000×m)×100，其中，C是樣品溶液中總黃酮的質(zhì)量濃度(mg/100 mL)，V是樣品溶液的體積，N是樣品溶液稀釋的倍數(shù)，m是樣品的重量(g)。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察：依次精密量取1、2、3、4、5、6 mL蘆丁母液至于25 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至25 mL，作為不同質(zhì)量濃度的蘆丁對照品溶液(空白：不加蘆丁對照品溶液)。用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法進(jìn)行顯色，用紫外-分光光度計(jì)在波長500 nm處測吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mg/100 mL)為橫坐標(biāo)(x)，吸光值為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=0.114 2x+0.004 2(r=0.999 6)，表明在0.32 mg/100 mL～16 mg/100 mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度試驗(yàn)：精密量取對照品溶液，按照“線性關(guān)系考察”項(xiàng)下，一次連續(xù)測定6次，RSD為0.052%，表明本儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)：利用響應(yīng)面法得到的最佳提取條件制備供樣品溶液1份，于室溫下放置0、3、6、12、24、48 h，按2.3項(xiàng)下方法顯色，以提取率為指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果RSD值為0.099%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)：利用響應(yīng)面法得到的最佳提取條件制備樣品溶液6份，按2.3項(xiàng)下方法顯色，以提取率為指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果RSD值為0.053%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.6 單因素試驗(yàn)

2.6.1 超聲時(shí)間對六神曲提取效率的影響：按照2.1項(xiàng)下方法，稱取六神曲藥材粉末10 g，以30 mL無水乙醇為提取溶劑，提取溫度為35℃，以考察提取時(shí)間10、20、30、40 min對六神曲中總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。隨著時(shí)間的延長，六神曲總黃酮提取率逐漸增高，且在30 min處達(dá)到最高值；超聲30 min后，提取率不斷下降。推測其原因，開始在超聲作用下，隨著時(shí)間延長提取液中總黃酮物質(zhì)不斷析出，但是如果時(shí)間過長，超聲波處理則會(huì)導(dǎo)致糖類等成分溶出增加，體系黏性增加進(jìn)而導(dǎo)致六神曲總黃酮提取率降低。故選擇30 min為最優(yōu)超聲時(shí)間，此時(shí)六神曲中總黃酮的提取效果最優(yōu)。

圖1 提取時(shí)間對六神曲總黃酮提取率的影響

2.6.2 溶劑濃度對六神曲提取效率的影響：按照2.1項(xiàng)下方法，稱取六神曲藥材粉末10 g，提取溫度為35℃，提取時(shí)間為30 min，以30 mL不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇為提取溶劑，以考察溶劑濃度40%、60%、80%、100%對六神曲總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)不斷加大溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)，六神曲中總黃酮提取率迅速增高，在體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%時(shí)，其提取率達(dá)到最大值，但之后隨溶劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，提取率不斷下降。推測其原因可能是當(dāng)乙醇濃度過高或過低時(shí)，導(dǎo)致溶劑的極性偏大或偏小，使得六神曲總黃酮提取率降低。故選擇80%為乙醇最優(yōu)濃度，此時(shí)對六神曲中總黃酮提取效果最優(yōu)。

圖2 溶劑濃度對六神曲總黃酮提取率的影響

2.6.3 料液比對六神曲提取效率的影響：按照2.1項(xiàng)下方法，稱取一定量的六神曲藥材粉末，以30 mL無水乙醇為提取溶劑，超聲時(shí)間為30 min，提取溫度為35℃。以考察藥材重量4、8、12、16 g對六神曲中總黃酮提取率的影響。結(jié)果見圖3。隨著藥材重量加大時(shí)，六神曲中總黃酮提取率逐漸增高；當(dāng)藥材重量達(dá)到12 g時(shí)，總黃銅提取率達(dá)到最高值，隨后加大藥材重量，提取率下降，說明當(dāng)藥材重量為12 g，提取溶劑為30 mL時(shí)，樣品中總黃酮基本已經(jīng)被全部提出，六神曲中總黃酮提取率不會(huì)隨著藥材重量的增加而增大，繼續(xù)增大藥材重量，其溶出量的變化不明顯，但消耗溶劑量明顯增加，同時(shí)去除溶劑負(fù)荷增加。故選擇12 g為藥材最優(yōu)重量，即料液比12∶30 (g/mL) 最優(yōu)。此時(shí)對六神曲中總黃酮提取效果最優(yōu)。

圖3 藥材重量對六神曲總黃酮提取率的影響

2.7 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素分析的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken的中心組合原理，以提取時(shí)間(A)、藥材重量(B)、溶劑濃度(C)為自變量，六神曲總黃酮提取率為因變量，采用3因素3水平響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design expert11建立數(shù)學(xué)回歸模型，確定六神曲總黃酮最佳提取工藝，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平詳見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平編碼

根據(jù) Box-Behnken 的組合設(shè)計(jì)原理，采用 Design-Expert 11.0 軟件設(shè)計(jì) 3 因素 3 水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)；以總黃酮提取率為響應(yīng)值，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果詳見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果

對表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸方差分析，得到六神曲中總黃酮提取率(Y)對提取時(shí)間(A)、液料比(B)、溶劑濃度(C)的三元二次多項(xiàng)擬合回歸方程：總黃酮提取率=0.050+0.005375A-0.002B-0.007625C-0.01AB-0.00125AC-0.0055BC-0.001925A2-0.003175B2-0.009425C2

表3 回歸模型方差分析

注：P<0.05表示差異有顯著性，P<0.01表示差異有非常顯著性，P>0.05表示差異無顯著性。

2.8 響應(yīng)曲面圖分析 通過對響應(yīng)曲面陡峭程度的分析，可以看出各因素隨取值變化對響應(yīng)值的影響。由圖4可知，在溶劑濃度一定的情況下，提取時(shí)間與藥材重量之間形成的曲面陡峭，說明2個(gè)因素的交互作用顯著，當(dāng)藥材重量在12～14 g，提取時(shí)間在25～40 min范圍時(shí)有較高的總黃酮提取效率。并且從曲面的陡峭程度可以看出，溶劑時(shí)間對提取效率的影響大于藥材重量。

圖4 提取時(shí)間和藥材重量對六神曲總黃酮提取效率的響應(yīng)面圖

在藥材重量一定的情況下，溶劑濃度與提取時(shí)間之間形成的曲面較陡峭，說明2個(gè)因素的交互作用較顯著，當(dāng)溶劑濃度在77%～83%，提取時(shí)間在25～35 min范圍時(shí)有較高的總黃酮提取效率，并且從曲面的陡峭程度可以看出，溶劑濃度對提取效率的影響大于提取時(shí)間。見圖5。

圖5 提取時(shí)間和溶劑濃度對六神曲總黃酮提取效率的響應(yīng)面圖

在提取時(shí)間一定的情況下，溶劑濃度與藥材重量之間形成的曲面較陡峭，說明2個(gè)因素的交互作用較顯著，當(dāng)溶劑濃度在77%～83%，藥材重量在11～14 g范圍時(shí)有較高的總黃酮提取效率。見圖6。

圖6 藥材重量和溶劑濃度對六神曲總黃酮提取效率的響應(yīng)面圖

通過觀察3個(gè)交互因素形成的曲面陡峭程度，提取時(shí)間與藥材重量的交互影響最大，其次是溶劑濃度與藥材重量和溶劑濃度與提取時(shí)間二者的交互影響。影響六神曲總黃酮提取效率因素的主次順序?yàn)槿軇舛?提取時(shí)間>藥材重量。以上分析與表3中方差分析結(jié)果吻合。

綜上，響應(yīng)面法優(yōu)化得六神曲中總黃酮超聲輔助提取工藝的最適條件為：超聲時(shí)間27.6 min、乙醇濃度 77.4%、料液比為13.3 g，在此條件下模型預(yù)測值為0.049%。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證利用 Design-Expert 11.0軟件優(yōu)化所得結(jié)果的可靠性，對六神曲中總黃酮超聲輔助提取工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證。選擇最佳提取工藝條件：超聲時(shí)間28 min、乙醇濃度 77%、藥材重量13 g。測得六神曲中總黃酮的提取率為0.046%，與模型預(yù)測值0.049%相近，說明方程擬合良好，響應(yīng)面優(yōu)化所得的六神曲提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

六神曲作為一種傳統(tǒng)的曲劑類中藥，原料廣泛，制備工藝較為簡單，但缺乏統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)，無法保證成品質(zhì)量，導(dǎo)致市場上六神曲質(zhì)量良莠不齊。近年來，響應(yīng)面法和超聲波輔助法相結(jié)合用于優(yōu)化提取工藝，具有簡單、快速、方便的優(yōu)點(diǎn)，故得以廣泛應(yīng)用。[14-15]此次研究在3個(gè)單因素的設(shè)計(jì)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化方法得到六神曲總黃酮超聲輔助提取法的最佳提取條件：藥材重量為 13 g(溶劑30 mL)，提取時(shí)間為28 min，溶劑濃度為77%。在此條件下六神曲總黃酮的提取率為0.046%，與模型預(yù)測值0.049%高度相符。故該方法能為六神曲中總黃酮的研究提供依據(jù)，同時(shí)為六神曲的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。