針刺對腹型肥胖小鼠肝臟病理及糖脂代謝影響的研究*

北京中醫藥大學東方醫院針灸科

于夢蕓 劉 迪 胡 慧 (北京100078)

提要 目的：研究針刺對腹型肥胖小鼠肝臟病理形態與糖、脂代謝的影響。方法：雄性C57BL/6J小鼠隨機分為空白組6只、造模組29只，建立腹型肥胖模型，以高脂飼料喂養12周后，將造模成功的12只小鼠隨機分為模型組6只和針刺組6只，繼續以高脂飼料喂養。將針刺組小鼠置于固定器內固定，針刺雙側“帶脈”穴，接電針，2 Hz/15 Hz疏密波，強度1.5 mA，隔日1次，每次15 min。模型組和空白組同步固定。共干預8周，HE染色觀察小鼠肝臟病理形態變化；取血檢測小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA)、空腹血糖值(FBG)和胰島素(INS)含量，并計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)。結果：與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、FBG、INS、HOMA-IR水平明顯上升(P<0.01或 P<0.05)，血清中HDL-C含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，針刺組小鼠血清中TC、TG、FBG、INS含量顯著下降(P<0.01或P<0.05)，HDL-C含量明顯上升(P<0.05)；血清中FFA含量呈空白組<針刺組<模型組趨勢，但差異無顯著性。HE染色可見模型組小鼠肝臟大量肝細胞排列紊亂，水腫和炎性細胞浸潤，局部脂肪變性；針刺組肝細胞排列整齊，少量炎性細胞浸潤，未見脂肪變性。 結論：針刺可以調控糖、脂代謝紊亂，對肝臟病理具有良性調節作用，改善腹型肥胖。

腹型肥胖(Abdominal Obesity)，又稱中心性肥胖，指脂肪在腹部或腹腔內臟器的過度沉積，臨床表現為腹部漸大，腰圍(WC)及腰臀比(WHR)增加。腹型肥胖是全身性炎癥、高脂血癥、胰島素抵抗(IR)和心血管疾病的主要風險因素。[1]美國國家膽固醇教育計劃成人治療組(NCEP-ATP)第3次報告提出了5個簡單的用于鑒別代謝綜合征(MS)的篩查變量，分別是WC、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、空腹血糖(FBG)和血壓(BP)。[2]其中，報告將WC特別列出，充分體現了腹型肥胖在MS中扮演的重要角色。

針刺是一種具有平衡陰陽，調理臟腑，運行氣血，疏通經絡等作用的“內病外治”的醫術。研究表明，針刺能逆轉肥胖小鼠脂肪、肝臟等組織形態學異常，改善腹腔內臟脂肪的異位沉積；[3]調節瘦素、抵抗素、脂聯素等脂肪細胞因子的釋放，糾正瘦素抵抗和IR等，[4]揭示針刺可從多方面控制肥胖的發生發展。本研究以高脂飲食誘導的腹型肥胖C57BL/6J小鼠為動物模型，以針刺帶脈穴為干預手段，觀察針刺治療對腹型肥胖小鼠肝臟病理變化和血清中總膽固醇(TC)、TG、HDL-C、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、游離脂肪酸(FFA)以及FBG、胰島素(INS)含量、胰島素抵抗指數(HOMA-IR)的作用，探討針刺通過調節糖脂代謝紊亂起到防治腹型肥胖的作用。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 清潔級4周齡雄性C57BL/6J小鼠35只，體質量(13～15)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號:SYXK(京)2012-0036, 飼養于北京中醫藥大學實驗動物中心SPF級動物房。飼養環境：室溫(22±2)℃，相對濕度50%～60%。人工控制室內照明，保持黑暗/光照為12 h交替循環。所有小鼠均可自由進食飲水，適應環境1周。隨機抽取6只小鼠為空白對照組采用一般飼料喂養，其余29只造模小鼠以高脂純合飼料喂養。

1.2 試劑與儀器 華佗牌一次性無菌針灸針(0.30 mm×25 mm，蘇州醫療用品廠有限公司)，小鼠固定器(150 mm×65 mm×50 mm，上海華巖儀器設備有限公司)，TC、TG、HDL-C、LDL-C試劑盒(南京建成生物工程研究所)，游離脂肪酸酶聯免疫試劑盒(上海酶聯)；CMNS6-1型脈沖針灸治療儀(無錫佳健醫療器械有限公司)，低溫離心機(美國Sigma)，標準酶標儀(美國Thermo Scientific)，電熱恒溫培養箱(黃石市恒豐醫療器械有限公司)，7100型全自動生化分析儀(日本日立)，CM1850冰凍切片機(德國Leica)，E200光學顯微鏡(日本Nikon)，NIKON digital sight DS-FI2成像系統(日本NIKON公司)，血糖試紙、血糖儀(強生醫療器材有限公司)。

1.3 動物模型制備 35只小鼠普通飼料喂養1周后。空白組繼續普通飼料喂養，造模組給予高脂純合飼料(購自Research DIETS公司,含20%蛋白、45%脂肪、35%碳水化合物，能量密度4.7 kcal/g)，喂養12周末，稱量體質量、腹圍。造模成功標準：造模組體質量、腹圍大于空白組平均值20%的小鼠被認定為腹型肥胖。[5-6]將造模成功的12只小鼠隨機分為模型組6只和針刺組6只，繼續以高脂飼料喂養。

1.4 干預方法 針刺組：根據《實驗針灸學》中常用實驗動物針灸穴位附圖中的取穴方法取雙側“帶脈”穴。將小鼠置于定制的固定器內固定，充分暴露腹部，用0.30 mm×25 mm一次性無菌針灸針，直刺雙側“帶脈”穴，深度3～4 mm，接電針儀的正負極，采用疏密波(2 Hz/15 Hz，1.5 mA)，隔日1次，15 min/次。模型組和空白組同步固定，不做任何其他處理。共干預8周。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 空腹血糖(FBG)測定：針刺干預結束后，小鼠禁食不禁水12 h后，采用剪尾取血的方法，用血糖儀試紙法測定小鼠 FBG值。

1.5.2 血清生化指標檢測：干預結束后，小鼠禁食不禁水12 h后稱重。小鼠腹腔注射麻醉后，采用眼球摘除法，從眼眶靜脈叢收集血液樣本約1.5～2 mL，置于EP管中，靜置1 h后，離心約15 min(4℃，2 500 r/min)。離心后取上清液放入凍存管中，保存于-20℃冰箱中備用。用全自動生化儀檢測血清中血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)含量。酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測FFA和INS含量，按試劑盒說明書操作。并根據公式(FBG×INS/22.5)計算HOMA-IR。

1.5.3 肝臟病理形態學觀察：取肝臟固定位置的一塊組織，經4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規取材，脫水，石蠟包埋，制片(4 μm厚)，HE染色，在光學顯微鏡下觀察并描述，對應主要描述部位進行拍照。

2 結果

2.1 各組小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、FFA含量變化 與空白組相比，模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯上升，差異具有顯著性(P<0.01或P<0.05)，血清中HDL-C含量明顯下降(P<0.05)；與模型組相比，針刺組小鼠血清中TC、TG含量明顯下降，差異有非常顯著性(P<0.01)，LDL-C含量呈下降趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)，HDL-C含量明顯上升，差異有顯著性(P<0.05)；血清中FFA含量呈空白組<針刺組<模型組趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。見圖1。

注：與空白組相比，# P<0.05, ## P<0.01；與模型組相比，* P<0.05, ** P<0.01。

2.2 各組小鼠FBG、INS、HOMA-IR值變化 與空白組相比，模型組小鼠FBG、INS、HOMA-IR水平明顯上升，差異有顯著性(P<0.001,P<0.01,P<0.05)；與模型組相比，針刺組小鼠的FBG、INS含量明顯下降，差異具有顯著性(P<0.01,P<0.05)，HOMA-IR值呈下降趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

注：與空白組相比，# P<0.05, ## P<0.01，### P<0.001；與模型組相比，* P<0.05, ** P<0.01。

2.3 各組小鼠肝臟病理形態變化 空白組肝細胞索排列緊密整齊，未見明顯炎癥和脂肪變性。模型組肝細胞索排列紊亂，可見大量肝細胞水腫，胞質疏松淡染；部分肝細胞氣球樣變性，細胞腫脹，核居中，胞質空泡化；局部可見淋巴細胞灶性浸潤。針刺組肝板排列整齊，結構清晰，肝竇未見明顯擴張或擠壓，局部可見少量炎性細胞浸潤，未見肝細胞脂肪變性。見圖3。

3 討論

腹型肥胖表現之一為TG在內臟脂肪細胞內的過度沉積，而內臟脂肪細胞的脂溶性狀態過高，胰島素的抗脂溶性作用被抑制。[7]由此產生的大量的非酯化脂肪酸(NEFA)進入肝臟可能會損害肝臟的新陳代謝，從而導致肝葡萄糖生成增加，載脂蛋白B降解減少，富含TG的脂蛋白增加。[8]同時過多的NEFAs可抑制肝糖原的利用，減少胰島素受體與胰島素的結合。進入血液循環后，導致胰島β細胞功能受損，通過抑制肌肉對葡萄糖的利用進一步導致IR。[9]可以說腹型肥胖是導致IR發生的重要因素。而IR是引發多種代謝異常的中心環節和發病機制。[10-11]IR與伴隨出現的高胰島素血癥也會同時升高FFA和TG含量，出現高甘油三酯血癥和低密度脂蛋白血癥，同時降低肝臟胰島素對糖異生和糖釋放的抑制作用，引起血糖升高。[12]本研究中經高脂飲食喂養的模型組小鼠出現TC、TG、LDL-C、FBG及HOMA-IR均升高而HDL-C下降的結果，符合腹型肥胖發病過程中糖脂代謝紊亂的特點。研究表明，肝臟的脂肪變性與腹型肥胖關系密切，腹腔脂肪的增加是其他異位脂肪增加的標志。[13]本研究的模型組小鼠病理顯示肝臟出現脂肪變性，與文獻結論一致。經過針刺干預后，一定程度改善了肥胖小鼠的糖脂代謝紊亂、IR以及肝臟脂肪變性。表明其干預方式對腹型肥胖的發展有良性調節作用，但具體機制待進一步研究。

圖3 各組小鼠肝臟病理形態變化(200×)

基于中醫理論體系來看，先天稟賦不足、飲食不節、勞逸失和、情志失調等均可導致腹型肥胖的發生。本研究從經絡辨證著手，以恢復經絡正常生理功能為方式，達到防治腹型肥胖的目標。帶脈環形腹部一周，因其獨特的循行路線，具有對縱行腰腹經脈的約束作用。帶脈失常則人體上下交通不利，氣機升降失常，清陽不升、濁陰不降，化生膏脂堆積于腹部，產生中心性肥胖，表現為“腰腹縱，溶溶如囊水狀”。采用通調帶脈法治療腹型肥胖，既能恢復帶脈對縱行經脈的約束功能，又能調控中焦氣機升降恢復正常；還符合“經脈所過，主治所及”的選穴依據，針對性治療腹部的脂肪組織。[14]因此本研究選用帶脈與足少陽膽經交會穴“帶脈穴”，以針灸激發帶脈經氣,恢復經脈氣血暢通，調節中焦氣機升降，促進人體代謝功能的恢復，從而起到減肥降脂的目的。

針灸治療腹型肥胖基于中醫整體觀和經絡辨證的基礎上，可多系統、多層面、多靶點調控人體各項功能，改善體脂參數、糖脂代謝紊亂及IR等癥狀。其中各個系統間的交互作用機制尚未完全明了，需進一步深入研究，相信仍有許多新型治療靶點有待挖掘，從而為臨床療效提供更好的指導。