微波協同酶法提取玫瑰花渣多糖工藝優化

姜曼，張偉

（濟寧職業技術學院生物與化學工程系，山東濟寧 272037）

玫瑰性甘、微苦，含有豐富的營養成分，有良好的食用、保健及藥用價值。我國玫瑰種植廣泛且目前絕大多數用于玫瑰精油的提取，但精油得率非常低（約0.03%）[1-2]，同時會產生大量的副產物如玫瑰花渣。研究發現，玫瑰花渣中含有大量的功能性有機物，如多糖、黃酮、酚類、維生素、β-胡蘿卜素等[3]，其中多糖含量高達30%[4]。作為一種植物多糖，玫瑰花渣多糖具有增強機體免疫、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等生物活性功能[5-8]，可將其提取、分離、純化，開發成新型原料功能性食品，迎合了目前提倡營養膳食的大潮流，也符合現代人的消費理念，潛力巨大。精油生產廠家通常會將玫瑰花渣作為垃圾直接丟棄，造成資源嚴重浪費，同時污染環境。充分利用副產物，“變廢為寶”，是解決這些問題、促進玫瑰產業的發展的有效措施。

目前，玫瑰花渣多糖的提取方法主要有熱水浸提法、酸堿提取法、微波輔助提取法、超聲波法、酶法提取等。水提法是提取植物多糖的傳統方法，但提取率低。馬猛華等[9]采用熱水浸提法提取玫瑰花渣中的多糖，時間5 h，提取溫度100 ℃，得率0.6%。張曰輝等[10]采用纖維素酶法提取玫瑰花渣多糖，酶反應時間150 min，可溶性多糖提取率為4.49%，提取時間較長。陳東明[11]利用超聲波提取玫瑰花渣多糖，超聲溫度20 ℃，提取時間3 h，多糖提取量為4.126 mg/g。由此可見，采用單一方法提取玫瑰花渣多糖存在提取率低、時間長的問題，本文采用微波協同酶法提取玫瑰花渣多糖，這在文獻中鮮見報道。以玫瑰花渣為原料，通過單因素試驗研究纖維素酶酶解溫度、纖維素酶酶解pH、微波處理時間、微波功率、料液比對玫瑰花渣多糖得率的影響，在此基礎上，采用正交試驗對工藝條件進行優化，確定微波協同酶法提取玫瑰花渣多糖的最佳工藝條件，為玫瑰花渣多糖的提取和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰花渣：提取玫瑰精油產生的副產物浸渣（山東津華生物技術有限公司提供），干燥后置于4 ℃冰箱，備用。纖維素酶：40 000 U/g，購自河北拓海生物科技。葡萄糖、濃硫酸、苯酚、丙酮、無水乙醇等試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1901 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；FA2004 電子天平，上海精密科學儀器有限公司；HHS-2 水浴鍋，上海天平儀器廠；KH30R-II 臺式通用高速冷凍離心機，湖南凱達科學儀器有限公司；格蘭仕P70F23P-G5 微波爐，佛山順德格蘭仕電器廠；DHG-9035 電熱恒溫鼓風干燥箱，華北實驗儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰花渣多糖的提取

將玫瑰花渣原料粉粹后過篩，稱取5 g 樣品，按料液比1:30（g/mL）加入去離子水，加入4.2%纖維素酶進行酶解，并以微波輔助提取。將浸提液在8 000 r/min 條件下離心10 min 后脫蛋白。重復浸提2 次，合并3 次上清液。將上清液減壓濃縮，用4 倍體積的無水乙醇沉淀多糖，定容至一定體積，得到玫瑰花渣粗多糖溶液。

1.3.2 單因素試驗

基于前期試驗的基礎，選擇酶解溫度（35、40、45、50、55、60 ℃）、酶解pH（3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8）、微波處理時間（2、3、4、5、6 min）、微波功率（200、350、500、650、800 W）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35，g/mL）分別進行單因素試驗。

1.3.3 正交試驗

根據單因素的試驗結果，選擇酶解溫度、微波功率、微波處理時間，以玫瑰花渣多糖含量為考察指標，設計三因素三水平的正交試驗，并對提取工藝條件進行優化。試驗設計見表1。

表1 試驗因素水平表Table1 Levels and factors of experiment

1.4 玫瑰花渣粗多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]。精確稱取葡萄糖100 mg，定容至1 000 mL，配制葡萄糖標準溶液。分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL 標準溶液至比色管中，加入1 mL、5%苯酚溶液、5 mL 濃硫酸，混勻，靜置15 min，于490 nm 波長處測吸光度。粗多糖得率計算公式見式（1）。

1.5 數據處理

利用Excel、SPSS 進行正交試驗設計及數據處理。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

選取不同濃度梯度的葡萄糖標準溶液，于波長490 nm處測定吸光度。以葡萄糖標準溶液濃度為自變量x，吸光度值為變量y，得到標準曲線回歸方程y＝0.132x+0.469 1，相關系數R2＝0.999 3，其線性關系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 酶解溫度對多糖得率的影響

由圖1 可知，隨著纖維素酶酶解溫度的升高，多糖得率先升高后降低，符合酶的一般特性。在35～50 ℃溫度范圍內，因為有酶的參與，反應速度明顯加快，多糖得率增加；隨著溫度的繼續增加，多糖得率呈現下降的趨勢，且下降幅度較大。這是由于纖維素酶此時活性降低甚至已經失活的緣故。45～50 ℃溫度區間范圍內多糖得率較高。綜合考慮，酶解溫度選擇40、45、50 ℃三個水平進行的正交試驗。

2.2.2 酶解pH 對多糖得率的影響

由圖2 可知，纖維素酶的酶解pH 變化規律與酶解溫度一致，先升高后降低。pH 為4.4 時，多糖得率最高；之后pH 升高，纖維素酶活性下降。因此，最佳酶解pH 確定為4.4。

2.2.3 微波功率對多糖得率的影響

圖3 顯示了微波功率對多糖得率的影響，由圖可知，玫瑰花渣多糖的得率與微波功率基本呈正相關。因為微波是一種穿透力極強的電磁波，微波處理相當于加熱，能使胞內成分溶出。當微波功率為650 W 時，玫瑰花渣多糖得率最高，為6.78%。當功率增加到800 W 時，多糖得率稍有下降，不過下降幅度不大?？赡苡捎谶^高功率升溫使多糖物質結構改變所致。綜合考慮安全性和能耗、成本問題，微波功率選擇350、500、650 W 三個水平進行正交試驗。

2.2.4 微波時間對多糖得率的影響

圖4 顯示了微波處理時間對多糖得率的影響，由圖可知，隨著微波處理時間的增加，多糖得率呈現先增加后減少的趨勢。當微波時間小于4 min 時，多糖得率逐漸升高，這可能是由于微波立體穿透的作用方式加快了多糖物質對基體的溶解。但試驗還發現時間大于4 min 后多糖得率逐漸降低。因此，微波處理時間選擇4 min。

2.2.5 料液比對多糖得率的影響

圖5 顯示了料液比在微波條件下對多糖得率的影響。由圖可知，隨著料液比的變小，多糖得率先增加后趨于平穩。由于傳質速度越來越快，有更多的玫瑰花渣多糖溶解到溶劑中。綜合考慮，料液比選擇1:30。

2.3 微波協同酶法提取的正交試驗

根據前期研究結果及單因素試驗，選擇酶解溫度、微波功率、微波處理時間這三個對多糖得率影響較大的因素進行正交試驗，結果見表2。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal experiment

由表2 可知，3 個因素對多糖得率影響的主次順序為A＞C＞B，即酶解溫度＞微波功率＞微波處理時間。正交設計得到的最優組合為A3B1C3，即酶解溫度50 ℃，微波功率650 W，微波處理時間4 min。此結果與正交試驗方案中第7 組試驗條件一致。因此，我們選出的最優方案是合理的。

3 結論

本試驗通過單因素試驗、正交試驗優化得到微波協同酶法提取玫瑰花渣多糖的最佳提取工藝條件，即纖維素酶加酶量4.2%，酶解溫度50 ℃，酶解pH 值4.4，微波功率650 W，微波處理時間4 min，料液比1:30，此時多糖得率為6.53%。與傳統熱水浸提法、微波法、超聲法、酶法等提取方法相比，該方法的提取條件溫和，多糖得率較高。后續研究可考慮采用兩種及以上復合酶（雙酶法）的形式，亦或是超聲波與酶法聯用提取玫瑰花渣多糖，可做進一步的研究。