熱滅活對輸血相關感染標志物的影響

佘宇奇，劉 瓊，周儉輝，戴立忠，鄧 勇，李 寧

(1. 中南大學湘雅醫院輸血科，湖南 長沙 410008； 2. 湖南師范大學附屬第一醫院檢驗科，湖南 長沙 410006； 3. 湖南圣湘科技股份有限公司研發部，湖南 長沙 410205)

2019年12月以來，湖北武漢市暴發多例新型冠狀病毒(2019-nCoV)肺炎[1]，隨后迅速席卷全國。截至2020年2月21日24時，中國大陸累計確診2019-nCoV肺炎76 288例，死亡2 345例[2]。2019-nCoV主要經呼吸道飛沫和密切接觸傳播，在相對封閉的環境中長時間暴露于高濃度氣溶膠情況下存在經氣溶膠傳播的可能[3]，有報道在糞便中也檢出2019-nCoV[4-5]。新型冠狀病毒肺炎潛伏期1～14 d，也有文獻報道最長為24 d，人群普遍易感[6]。2019-nCoV與嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)同屬于β屬的冠狀病毒，滅活SARS-CoV的方法同樣能夠滅活2019-nCoV[7]。SARS-CoV病毒對紫外線和熱敏感，56℃ 30 min、丙醇、乙醇等均可有效滅活病毒[8-9]。

2019-nCoV傳染性很強，對未經培養的感染性材料的操作要求在生物安全二級實驗室進行，同時采用生物安全三級實驗室的個人防護[10]。在臨床實驗室檢測過程中需要多次接觸患者標本，如編號、離心、混勻、開蓋、加樣和轉移等，同時操作中會產生大量氣溶膠，每多一次操作均會增加實驗室工作人員感染的概率。減少與病毒的接觸是降低實驗室工作人員感染最簡單、有效的辦法。實驗室可以通過增加防護物資，提高防護等級阻斷病毒向工作人員傳播。但2019-nCoV疫情的發生臨近春節長假，防護裝備生產廠家都已停工，防護裝備緊缺，特別是2019-nCoV疫情發源地武漢。若安全防護不到位，很大程度上增加實驗室工作人員感染的風險。數據顯示截至2月11日，已有1 716名醫務人員確診2019-nCoV肺炎，并導致5名醫務人員死亡[11]。如何減少醫源性感染是我們面臨的一個重要課題。若對患者血標本進行病毒滅活處理，再對滅活后的血標本進行實驗室檢測，能夠有效減少實驗室工作人員與病毒的接觸，降低醫源性感染的發生。本研究對乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗體(抗-HCV)、人類免疫缺陷病毒抗體(抗-HIV)、梅毒螺旋體抗體(抗-TP)、乙型肝炎病毒(HBV) DNA和丙型肝炎病毒(HCV) RNA陽性血清和全血標本進行56℃加熱30 min滅活病毒處理，分析滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA水平的差異，為特殊情況下減少實驗室工作人員醫源性感染提供參考經驗。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集57份陽性血清標本，其中HBsAg陽性、抗-HCV陽性、抗-HIV陽性和抗-TP陽性標本各10份，HBV DNA陽性標本9份，HCV RNA陽性標本8份；收集38份用分離膠促凝管采集的陽性全血標本，其中HBsAg陽性、抗-HCV陽性和抗-TP陽性標本各10份，HBV DNA陽性標本8份。

1.2 研究方法 血清標本直接放入56℃水浴箱加熱30 min滅活病毒；全血標本首先3 000 r/min離心10 min，不分離血清，直接將標本放入56℃水浴箱加熱30 min滅活病毒。采用美國雅培公司HBsAg定量測定試劑盒、HCV抗體測定試劑盒、HIV抗原及抗體聯合測定試劑盒和TP抗體測定試劑盒(化學發光微粒子免疫檢測法)分別檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV和抗-TP；采用圣湘生物公司HBV核酸檢測試劑盒和HCV核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)測定HBV DNA和HCV RNA，比較熱滅活前后各指標檢測水平的差異，并分析滅活前后兩者的一致性。HBsAg以IU/mL表示，抗-HCV、抗-HIV和抗-TP結果以S/CO值表示，HBV DNA和HCV RNA結果以循環閾值(Ct)表示。

1.3 儀器 雅培全自動化學發光免疫分析儀i2000SR(美國)，恒溫水浴箱(中國上海)，宏石PCR儀SLAN-96P(中國上海)。

1.4 統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件對數據進行分析，數據的比較采用配對t檢驗。以滅活后與滅活前的差值作縱軸，滅活后與滅活前的均值作橫軸，作Bland-Altman圖分析滅活前后的一致性。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血清標本滅活對輸血相關感染標志物檢測的影響 血清標本56℃加熱30 min滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA的結果如圖1所示，采用配對t檢驗，熱滅活前后每個指標比較差異均無統計學意義(均P>0.05)。Bland-Altman圖分析見表1和圖2，所有的點均位于95%LoA上限與下限之間，符合至少95%的點在95%LoA范圍內，表明血清滅活前后輸血相關感染標志物的水平一致性較好。

A—F為血清標本，G—J為全血標本。

表1 輸血相關感染標志物熱滅活前后Bland-Altman圖參數

Table 1 Parameters of Bland-Altman diagram of blood transfusion-related infection markers before and after heat inactivation

項目標本例數滅活前后差值均數差值標準差95%LoA范圍HBsAg血清102.7153.891(-4.912, 10.342)抗-HCV血清10-0.3420.891(-2.088, 1.404)抗-HIV血清106.73112.393(-17.559, 31.020)抗-TP血清10-0.1480.364(-0.862, 0.566)HBV DNA血清9-0.0040.140(-0.279, 0.270)HCV RNA血清80.6901.358(-1.972, 3.352)HBsAg全血101.2431.894(-2.470, 4.956)抗-HCV全血10-0.1330.302(-0.725, 0.459)抗-TP全血100.0900.168(-0.239, 0.419)HBV DNA全血8-0.6191.242(-3.054, 1.816)

2.2 全血標本滅活對輸血相關感染標志物檢測的影響 全血標本56℃加熱30 min滅活前后HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA的結果如圖1所示，采用配對t檢驗，熱滅活前后每個指標比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。Bland-Altman圖分析見表1和圖3，所有的點均位于95%LoA上限與下限之間，符合至少95%的點在95%LoA范圍內，表明全血滅活前后輸血相關感染標志物的水平一致性較好。

“----”線從上至下依次為95%LoA上限、差值平均值和95%LoA下限。

“----”線從上至下依次為95%LoA上限、差值平均值和95%LoA下限。

3 討論

國家衛生健康委員會將2019-nCoV肺炎納入法定傳染病乙類管理，但采取甲類傳染病的預防、控制措施。有報道表明，2019-nCoV比SARS-CoV、中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)更具有傳染性[12-13]。為減少臨床實驗室醫源性感染的發生，本研究對血清和全血標本加熱滅活病毒，分析滅活前后輸血相關感染標志物水平的差異，結果表明56℃加熱30 min滅活血清標本，檢測HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP、HBV DNA和HCV RNA，結果與滅活前無差異；56℃ 30 min滅活全血標本，檢測 HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA，結果與滅活前無差異，滅活前后具有較好的一致性。該熱滅活的方法操作簡單，僅需56℃恒溫水浴箱，可考慮作為一種減少實驗室工作人員醫源性感染的方法。

類似研究[14-15]采用血清標本進行熱滅活，但實踐中分離2019-nCoV肺炎患者血清或血漿的操作有暴露的風險，故設計不分離患者血清，而直接采用全血進行56℃熱滅活的方法。全血熱滅活時血標本內紅細胞發生嚴重溶血，釋放血紅蛋白和細胞碎片，干擾試驗結果[16-18]，故選用帶分離膠的促凝管采集全血。血液分離膠是一種黏性流體，將標本離心后，分離膠在血清和細胞之間形成隔離層，該隔離層可以牢固的黏附在采血管內壁，阻止血清層與細胞層間的相互擴散[19-20]。在分離膠的作用下，56℃熱滅活造成的細胞溶血基本對試驗結果沒有干擾。本組試驗結果證實，熱滅活全血標本不會影響HBsAg、抗-HCV、抗-TP和HBV DNA的檢測結果。相比于滅活血清標本，滅活全血標本操作更簡單，而且減少了實驗室工作人員暴露的風險，可考慮作為實驗室工作人員防止醫源性感染的首選方法。

開展輸血相關感染標志物檢測不僅能夠區分患者是否為輸血后感染經血傳播疾病，還可以發現潛在的傳染源,有助于醫務人員加強操作隔離防護[21]。在疫情期間，疑似或者確診2019-nCoV感染患者需要檢測輸血相關感染性標志物，建議采用含分離膠的促凝管收集全血標本。血液凝固后離心，停止后等待不少于15 min，待氣溶膠自然沉降下來后打開離心機蓋，用75%乙醇噴霧消毒[22]。取出后不分離血清直接將全血56℃熱滅活30 min，然后進行實驗室檢測。這樣能夠在病毒被滅活前最大程度減少實驗室工作人員的暴露，減少醫源性感染的發生[23]。實際上，在2019-nCoV肺炎流行的時候，本院輸血科一直采用熱滅活的方法處理疑似或確診患者的輸血相關感染標志物標本,但由于其檢測結果均為陰性，所以未納入本研究。本研究還存在一些局限，新冠肺炎疫情發生后，一方面全國各地采取了交通管制、限制人員流動等管控措施；另一方面醫院暫停了門診和擇期手術。導致未收集到抗-HIV、HCV RNA和HIV RNA陽性的全血標本及HIV RNA陽性的血清標本，需要在以后繼續收集樣本。核酸具有良好的熱穩定性，56℃熱滅活后，病毒的酶活性、結構蛋白和膜結構遭到破壞，失去復制能力，但是通過PCR的方法還能夠檢測到核酸物質[24]。結合前面的試驗結果，可以推測熱滅活的方法也同樣適用于HIV RNA和全血HCV RNA的檢測，文獻[24-26]結果與此推測一致。此外，該方法有一定的限制性，如針對紅細胞的實驗室項目、血清酶學、凝血功能和補體檢測不適合做熱滅活，其他的實驗室項目則需要進一步的驗證。