食管鱗癌中TROP2與EMT的表達及相關性研究

雷海鳴 李 劍 周鑒基

1.江蘇醫藥職業學院臨床醫學院，江蘇鹽城 224005；2.江蘇省鹽城市第二人民醫院外科，江蘇鹽城 224003

食管癌是全球一種常見的惡性消化道腫瘤，我國是食管癌的高發地區，在國內惡性腫瘤中其發病率排第四位，全球約60% 的食管癌發生在我國[1]。鱗狀細胞癌和腺癌是食管癌的主要組織學類型，大約90%為鱗狀細胞癌[2]。其早期臨床癥狀不典型，診斷比較困難，雖然外科手術和放化療等治療方法在不斷發展，但預后仍然較差，5 年生存率仍然相對較低，其主要原因與腫瘤的浸潤、轉移和復發等因素有關。

人滋養層細胞表面抗原2（trophoblastic cell surface antigen 2，TROP2）是一種單跨膜表面糖蛋白，也稱為膜組分表面標志物-1 和腫瘤相關鈣信號轉導物-2，是TACSTD2 基因的蛋白質產物，參與細胞內鈣離子濃度的調節[3]。TROP2 首次被發現于人類滋養層細胞中，是侵襲人類滋養層細胞的生物學標記，并發現其與細胞周期蛋白D1 和蛋白激酶C（PKC）水平的調節有關，后者激活有絲分裂原激活的蛋白激酶/細胞外信號調節激酶（MAPK/ ERK）途徑可以增加細胞周期蛋白D1 和細胞周期蛋白E 的表達[4]。通過調節細胞生長、遷移和自我更新，Trop2 在發育和腫瘤發生中具有多方面的作用[5]。TROP2 是一種致癌基因，與多種類型的惡性腫瘤的發生、發展和轉移密切相關[6-10]。 此外，在某些消化道癌癥中，升高的TROP2 表達與淋巴結轉移、腫瘤分化和其他臨床病理特征顯著相關[11-12]。上皮-間質轉化(EMT)是指上皮細胞在生理或病理情況下向間質細胞的轉變，研究發現，EMT 不僅在人類胚胎的發育過程中起作用, 也是導致腫瘤侵襲、轉移的一個重要機制[13-14]。

本研究通過檢測TROP2 和EMT 標記物在食管鱗癌組織中的表達，以及癌旁正常組織TROP2的表達，分析并探討TROP2 與食管鱗癌侵襲、轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年1 月～2019 年10 月江蘇省鹽城市第二人民醫院行手術治療的50 例食管癌患者的癌組織、癌旁正常組織（距離癌灶邊緣＞5cm，病理證實未發現腫瘤細胞）。所有患者在術前未發現明顯手術禁忌證，均未進行放射、化學和靶向等治療，術后病理檢查均為鱗狀細胞癌。男39 例，女11 例，年齡42 ～75 歲，平均61.1 歲。根據第8 版AJCC食管癌TNM 分期：Ⅱ期32 例，Ⅲ～Ⅳ期18 例。浸潤深度：T1 ～T2 40 例，T3 ～T4 10 例。組織分化程度：高分化3 例，中分化35 例，低分化11 例，未分化1 例。淋巴結轉移：發現淋巴結轉移13 例，未發現淋巴結轉移者37 例。見表1。

1.2 納入標準

（1）所有患者術前和術后病理組織檢查均已確診；（2）無嚴重心臟及肝臟疾病、凝血功能障礙；（3）術前均未進行放射、化學和靶向等治療。

1.3 方法與主要試劑

用免疫組織化學法檢測TROP2 及EMT 相關標記物的表達，兔多克隆抗TROP2 抗體、E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 抗體購自（美國Santa Cruz公司），山羊抗兔二抗（凱基生物科技有限公司）。采用SP 法，10%甲醛固定標本后石蠟包埋，行連續切片，每張組織切片4μm，烤片2h，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，0.01mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液抗原熱修復，3%H2O2孵育以阻斷內源性過氧化物酶，加一抗（稀釋比例TROP2 為1 ∶100，E-cadherin、N-cadherin和Vimentin 為1 ∶200），4℃孵育過夜，PBS 清洗3次，每次5min，二抗在37℃下孵育30min，PBS 清洗3 次，每次5min，DAB 室溫顯色，蒸餾水沖洗終止顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，在顯微鏡下觀測并拍照。

1.4 結果判斷

鏡下觀察，每張切片選取5 個高倍視野（×400），按細胞是否著色分為陽性和陰性，TROP2、E-cadherin 和N-cadherin 的陽性著色均位于細胞膜和細胞質，Vimentin 陽性著色位于細胞質（圖1），均呈棕黃色顆粒，根據陽性細胞所占的比例進行評分，＜20%為陰性，≥20%為陽性。

圖1 食管鱗癌組織中TROP2、N-cadherin，vimentin 和E-cadherin 的表達（×400）A.TROP2；B.N-cadherin；C.Vimentin；D.E-cadherin

1.5 統計學處理

應用SPSS20.0 統計軟件進行統計分析，組間比較采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman 分析，P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TROP2在食管鱗癌與癌旁正常組織中的表達

50 例食管鱗癌組織中TROP2 的陽性表達率為62.0%（31/50），癌旁正常組織的陽性表達率為19.0%（8/42），差異有統計學意義（χ2=22.236，P ＜0.001）。

2.2 TROP2的表達與臨床病理資料間的關系

TROP2 在不同性別、年齡、浸潤深度、組織學分級、淋巴結轉移及臨床分期中的表達情況見表1。TROP2 的表達與患者的性別（χ2=0.160，P=0.899）、年 齡（χ2=0.536，P=0.464）無 關，與 組 織 學 分級（χ2=5.898，P=0.015）、浸 潤 深 度（χ2=4.160，P=0.041）、臨床分期（χ2=8.631，P=0.003）及淋巴結轉移（χ2=7.273，P=0.007）有關。

表1 TROP2的表達與食管鱗癌患者臨床病理特征之間的關系

2.3 食管鱗癌中TROP2的表達與EMT相關標記物表達的相關性

TROP2、N-cadherin、Vimentin 和 E-cadherin在食管鱗癌組織中的陽性表達率分別為62.0%、54.0%、56.0%、40.0%。分析顯示，食管鱗癌組織中TROP2 的表達與N-cadherin 表達呈正相關（r=0.352，P=0.012)，與Vimentin 表達也呈正相關（r=0.468，P=0.001)，而與E-cadherin 表達呈負相關（r=-0.454，P=0.001)。見表2。

3 討論

食管鱗癌是食管癌的最主要類型，其特點是侵襲性高、預后較差，發生發展與多種因素密切相關，侵襲和轉移是影響預后的重要因素。尋找可靠的預后相關分子標志物，對于食管鱗癌的預后判斷、提高療效具有重要的臨床指導意義。

滋養層細胞表面抗原2（TROP2）由323 個氨基酸組成，在內質網中合成，運輸到高爾基體中被糖基化，是一種鈣信號轉導因子，作為腫瘤驅動因子可驅動惡性腫瘤生長[15]，在惡性腫瘤進展中起重要作用[16]。TROP2 的表達和（或）活性改變與癌細胞的生長、增殖、遷移、侵襲和存活有關，是惡性腫瘤患者預后的潛在標志[17]。本研究結果顯示，TROP2 在食管鱗癌組織中的表達高于癌旁正常組織（P ＜0.05），提示TROP2 可作為食管鱗癌診斷的分子標志物。其表達與患者的性別、年齡無明顯相關（P ＞0.05），與組織學分級、淋巴結轉移、浸潤深度及TNM 臨床分期有相關性（P ＜0.05），提示TROP2 對食管鱗癌的侵襲、轉移可能具有促進作用。

上皮-間質轉化（EMT）被認為在癌癥的侵襲和轉移過程中具有重要作用[18]，在此過程中，上皮細胞失去其特性，并獲得間質表型，EMT 促進腫瘤細胞遷移和侵襲，導致免疫抑制，并阻止細胞凋亡和衰老[19]。N-cadherin 的表達上調及E-cadherin的表達下調是EMT 的主要表現[20]。Trop2 通過誘導乳腺癌中EMT 過程促進了乳腺癌細胞的遷移和侵襲，導致淋巴結受累和遠處轉移[21]。膽囊癌中，TROP2 可通過調節PI3K/AKT 途徑誘導EMT 來促進膽囊癌細胞的增殖、遷移和轉移[22]。通過對食管鱗癌組織中TROP2 與EMT 相關標記物的相關性分析，提示TROP2 可能通過調控EMT 標記物的表達而促進EMT 的發生，在食管鱗癌侵襲和轉移中發揮重要作用。

總之，在食管鱗癌組織中TROP2 高表達，可能與食管鱗癌的進展密切相關，TROP2 可以作為食管鱗癌的潛在治療靶標。多種細胞因子、信號通路等因素可調控EMT 的發生，TROP2 可能具有誘導食管鱗癌中EMT 過程的作用，但其具體作用機制尚不清楚，有待后期進一步的研究。