環境溫度和酸堿變化適應性廣的纖維素降解菌復合系篩選

肖艷萍, 張仕穎,包 立, 趙丹丹，張乃明*

(1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650201；2.云南省土壤培肥與污染修復工程實驗室/云南省土壤資源利用與保護創新團隊，云南 昆明 650201；3.云南省貿易經濟學校,云南 昆明 650204；4.云南省農業科學院農業經濟與信息研究所,云南 昆明 650231)

【研究意義】農業秸稈等資源的不當焚燒不僅帶來環境污染，還造成資源浪費。生物堆肥可以將秸稈資源等有效利用起來，是實現農業有機固體廢物無害化、減量化、資源化的重要手段。【前人研究進展】在堆肥中，微生物的作用至關重要，很多研究都發現微生物能促進和優化堆肥過程[1]，增加全氮、有效磷及速效鉀的含量，提高堆肥品質等[2]；有研究發現AM真菌能夠促進還田稻稈的分解，促進有機質的養分釋放[3]。復合微生物的研究和開發一直是堆肥領域的一大熱點。然而，微生物菌劑在實際使用時，由于受到周圍環境中生物與非生物因素的影響，復合微生物的適應性和競爭力在復雜環境中往往會發生變化，導致廢棄物降解效果不佳，這是復合微生物在生物堆肥應用中存在的一個巨大缺陷，例如堆肥中一些降解菌在高溫下失活[4]，一些微生物菌在低溫和堿性條件下其對纖維素的降解功能不能正常發揮等[5]。【本研究切入點】理論上，不同環境適應類型的微生物共同作用，或高環境耐受性微生物可能對纖維素廢棄物的降解具有較好的作用。因此，盡可能讓使用的菌劑不單一化，增強其環境的穩定性和耐受性，也許對降低菌劑在復雜環境中的堆肥具有利好。因此，采用不同適用類型的微生物制成微生物菌劑，同時篩選環境適應性強的微生物投入實際環境中使用，可能更加有利于廢棄物在不同發酵階段的腐解。【擬解決的關鍵問題】探究和篩選一種具有環境適應能力的纖維素降解菌復合系，以期能夠降低實際堆肥過程中非特定環境因素對菌系功能穩定性的影響，降低環境溫度變化、酸堿變化等對微生物菌系的影響，有利于纖維素降解菌復合系在生物堆肥過程中發揮其功能作用，從而促進堆肥腐熟。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用20株具有纖維素分解能力的菌株作為供試菌，所有菌株都直接從自然生態環境中分離得到,具有降解纖維素的能力,為實驗室前期分離所得，詳見表1，分類種屬均未鑒定。

采用的主要培養基為羧甲基纖維素鈉液體發酵培養基[6]，主要設備為全溫搖瓶柜、水浴恒溫振蕩器、小型離心機、基本型火焰光度計、電熱恒溫鼓風干燥箱、蒸汽滅菌器、接種箱等。

1.2 試驗方法

首先采用正交試驗構建復合微生物菌系。將20株供試菌株隨機分成4組，每組5株菌, 按照4因素5水平正交表[7]組合構建得到25組復合微生物菌系(CM1-CM25)，詳見表2～3。第2步，對每一組復合菌進行拮抗關系試驗。第3步，對復合菌系進行篩選。不同溫度條件下的CMC酶活測定。基本操作：把復合菌系的各個菌株接種到250 mL三角瓶液體發酵培養基中，放置到搖床上，120 r/min，28 ℃恒溫振蕩培養，采用DNS法分別測定35、45、55 ℃的CMC酶活。不同酸堿條件下的CMC酶活測定。基本操作：采用DNS法，測定不同pH值條件下(pH 6、7、10)的CMC酶活。FPA濾紙酶活測定。基本操作：把復合菌系的各個菌株分別接種到250 mL三角瓶液體發酵培養基中，并在三角瓶中各加入1根1.0 cm×5.0 cm的濾紙條作為底物降解試驗的外觀指標，并對復合菌系的FPA濾紙酶活進行測定。通過測定不同條件下的CMC酶活，以及FPA濾紙酶活, 篩選得到目標組合菌株。第4步，對目標復合菌進行復篩[8]。制備復合菌的菌種擴大培養液，測定菌株之間的協同作用。采用濾紙崩解試驗：在濾紙條液體發酵培養基中分別接入一定量的菌液(單一菌液，復合菌液以及空白對照)，并在發酵液中加入1根1.0 cm×5.0 cm的濾紙條，觀察濾紙崩解情況。篩選最適復合菌搭配比例。采用三角瓶濾紙條饋爛實驗：按照4因素3水平正交表(表4)，設10、20和30 mL 3個接種量，對最優菌系的4株菌進行最適組合比例篩選，同時備一個空白試驗，不加任何微生物菌液；在每個試驗中都加入同等重量的濾紙條，觀察濾紙條的潰爛情況。第5步，分子鑒定。

表1 菌株基本情況

表2 供試菌株分組及編號情況

表3 復合微生物菌構建情況

1.3 數據分析

采用SPSS 20.0和Microsoft Office Excel 2007進行相關數據分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗關系篩選結果

羧甲基纖維素培養基平板上的“十”字點接培養發現，在25組復合菌系中，有14組生長正常；7組存在一定生長抑制，但是各株菌間并沒有觀察到明顯的拮抗和抑制孢子生成等現象；其他的4組(CM7、CM9、CM18和CM20)則存在顯著的生長拮抗和抑制現象，表現為菌株組合在培養基上生長緩慢、菌落小，有的直接不生長。復合菌系菌株間的拮抗關系試驗結果，將組合待篩選的25組菌系直接篩選為21組。這一篩選結果也表明了復合菌系的組合是需要進行篩選的，隨意的組合不一定有利于菌株的生長，也可能直接抑制其生長，對組合菌的功能會起到不利的作用，也不便于復合菌的混合發酵培養。在復合菌系的進一步篩選中，將不再對CM7、CM9、CM18和CM20進行研究，25組待選菌系減少為21組。

表4 復合菌系最適混合比例篩選

2.2 不同溫度、酸堿度等條件下復合菌系的篩選結果

從表5可見，21組待篩組合均表現出不同的分解纖維素的CMC酶活和濾紙PFA酶活。(1)CM3、CM16、CM5、CM11、CM2、CM8、CM4、CM12、CM13和CM14共10組菌對溫度變化和酸堿度變化較為敏感，環境適應性范圍相對窄。在環境變化過程中，特別是在高溫環境和高堿性環境中，該組合菌的纖維素的降解功能便失效，或是CMC酶活降低，直至無法再進行纖維素的分解。

表5 復合菌系在不同條件下的酶活

圖1 CM3等10組菌在不同環境條件下的CMC酶活 Fig.1 CMC enzyme activities of 10 groups of bacteria such as CM3 under different environmental conditions

圖2 CM3等10組菌在pH 7.5的濾紙FPA酶活 Fig.2 FPA enzyme activities of 10 groups of bacteria such as CM3 in pH 7.5

在圖1中，隨著溫度由35 ℃，經過45 ℃，升高為55 ℃，這10組菌的酶活逐漸降低，表現出對溫度升高的不耐受性，在55 ℃高溫條件下，基本已無法再分解纖維素，酶活檢出基本均為負數；在酸堿變化條件下，由酸性條件(pH 6)逐漸變為高堿性條件(pH 10)時，這10組菌從有酶活至無酶活，表現出對酸性條件的適應性和對堿性，特別是高堿性條件的極不耐受性。不同環境條件下的CMC酶活測定結果表明，這10組菌只適合在中低溫條件和酸性條件下分解纖維素，在高溫條件和堿性條件下，纖維素分解能力受到抑制。生物堆肥的環境變化極為復雜，同時，堆肥中存在高溫階段變化，這10組菌對高溫和堿性的極度敏感和不耐受性，決定了其不適合作為生物堆肥菌劑，如果非要使用它們作為菌劑，也只能應用于堆肥前期，堆肥升溫后將無法發揮作用。此外，在圖2中，未檢測到CM2和CM3的濾紙FPA酶活，其他8組菌都具有一定的濾紙FPA酶活。圖1～2結果表明，CM3等10組菌屬于中低溫和酸性環境適應性組合菌，對高溫和堿性環境存在環境不耐受性。

CM1、CM23、CM24、CM15、CM10、CM6、CM25、CM22、CM21、CM19和CM17共11組菌對溫度變化和酸堿度變化的敏感性存在差異。如圖3所示，溫度變化對該11組菌的CMC酶活影響不敏感，表現為在低溫、中溫和高溫條件下的酶活變化趨勢不顯著，相對低溫35 ℃和高溫55 ℃，該11組菌在45 ℃表現得更為活躍一些，低溫到高溫的變化并沒有對其酶活產生明顯的抑制作用，除了CM10，該組合菌在低溫時酶活表現活躍，隨著溫度升高，其酶活受到明顯抑制，該菌比較偏好低溫環境。酸堿變化對該11組菌的酶活影響較為顯著；在pH 6的酸性環境和pH 7.5的弱堿性環境中，它們的酶活變化并不明顯，說明，它們對酸性和弱堿性環境具有一定的適應性，然而，當環境變為高堿性環境，CM25、CM21和CM19的酶活表現為受到明顯抑制，說明，CM25、CM21和CM19不能耐受堿性條件，偏喜酸性和弱堿性環境；其他8組菌并沒有受到堿性環境的抑制，反而表現出對堿性環境的偏好，酶活不僅沒有受到抑制反而升高了。在CM1等11組菌中，無論溫度條件改變還是酸堿條件改變，CM17的酶活都比較穩定，既能適應高溫環境，在酸性和堿性環境中仍然表現良好。

由圖3分析得到，CM10為低溫適應型；CM25、CM21和CM19為不耐受堿性條件型；CM1、CM23、CM24、CM15、CM6、CM22和 CM17為溫度耐受型，同時比較偏好堿性環境，它們的環境適應性相對較廣。

圖3 CM1等11組菌在不同環境條件下的酶活Fig.3 Enzyme activities of 11 groups of bacteria such as CM1 under different environmental conditions

圖4 CM1等11組菌在不同環境條件下的酶活 Fig.4 Enzyme activities of 11 groups of bacteria such as CM1 under different environmental conditions

從圖4可見，CM17的柱形最為整齊，在35、45和55 ℃，以及pH 6、7.5和10都有明顯的柱形表現，其他組合的柱形表現相對欠佳，不是柱形差距太大就是某些柱形的酶活為負值。CM17的柱形表明，該菌系對溫度變化和酸堿變化的適應性較穩定。

從圖5可見，CM17具有最大的累積酶活，CM17在不同環境條件下，都具有較好的CMC酶活，纖維素分解能力較佳。

從圖6可見，CM1等11組菌中，CM1和CM6未檢測到濾紙FPA酶活，其他組合都具有濾紙FPA酶活，表明CM1和CM6的綜合纖維素分解能力較弱。

圖5 CM1等11組菌在不同環境條件下的酶活 Fig.5 Enzyme activities of 11 groups of bacteria such as CM1 under different environmental conditions

圖6 CM1等11組菌的在pH 7.5的濾紙FPA酶活 Fig.6 FPA enzyme activities of 11 groups of bacteria such as CM3 in pH 7.5

a, b, c, d分別是CD53、LS14、CD52和TD21菌株在CMC瓊脂培養基上的生長菌落a, b, c and d showed the colonies of the CD53, LS14, CD52 and TD21 on CMC agar medium, respectively圖7 CM17在平板培養基上的生長情況Fig.7 The growth of the CM17 on CMC plate

圖8 CM17、D4等的濾紙完全崩解時間Fig.8 The time of completely dissolving the filter paper for CM17,D4 and other strains

(3)通過比較分析，將CM17作為篩選的目標菌，該菌系無論在酸性環境、堿性環境，還是低溫、高溫，都具有較好的纖維素分解能力，對環境具有廣泛的適應性，其在35、45和55 ℃，pH 6、7.5和10的酶活分別為130.2597、107.7475、95.4294、54.2985、95.4294 和105.4821 U，平均CMC酶活為98.1078 U，并且其濾紙FPA酶活為23.7158 U。

2.3 CM17復合菌的形態及鑒定

D4(CD-53)、Z2(LS-14)、G5(TD-21)和S3(CD-52)4株菌組合構成了復合菌劑CM17，各菌株的菌落形態特征及16SrDNA分子鑒定如圖7。分子鑒定結果表明，CM17復合菌劑里包含有菌鏈格孢屬Alternaria，鏈霉菌屬Streptomyces，厄氏菌屬Oerskovia，短梗霉屬Aureobasidium等菌，是一個包含有細菌和真菌的復合菌劑。

2.4 CM17的進一步篩選研究

2.4.1 復合菌劑協同作用 從圖8可見，CM17組合菌系比其單菌株具有較好的纖維素分解效果，同等條件下完全崩解同等重量的濾紙，CM17需要72 h(3 d)，而D4、G5、S3、Z2等單菌株分別需要7、11、15和18 d；CM17的纖維素分解效率至少是其單菌株的2.33倍。由此可見，CM17分解纖維素的效率較高，究其原因，是由于復合菌之間的協同分解作用提高了CM17的濾紙崩解效率。

圖9 不同混合比例的CM17的濾紙分解結果 Fig.9 The filter paper disintegration ratio of CM17 mixed with different proportions

2.4.2 CM17的最適搭配比例 從圖9可見，D4、Z2、G5、S3按照不同比例混合的CM17，它們的72 h濾紙崩解結果表明，復合菌系各菌株之間的協同作用會受到各菌株組合量的影響。當D4，Z2，G5，S3的混合體積比例為1∶1∶1∶1時，該菌系的濾紙分解率高達35.79 %；但是，當D4∶Z2∶G5∶S3的混合比例為1∶3∶3∶3時，CM17的濾紙分解率僅為0.22 %。該結果表明，CM17復合菌劑中，D4等4種菌的含量大小會影響CM17對濾紙的降解能力，影響其對纖維素的協同降解作用。由D4，Z2，G5，S3按照1∶1∶1∶1混合的CM17，具有較佳的協同降解纖維素的能力，能有效的提高菌劑降解纖維素的效率。

3 討 論

一般在篩選復合微生物時，很多都選擇直接從相應的環境條件或土壤中分離出優勢菌，再進行組合研究，培養成復合微生物，例如從土壤中分離純化出不同類型的微生物菌株，再選擇搭配優勢群體培養成復合微生物菌劑[9]。在復合微生物菌劑的制備中，各個菌種復合的比例是一個影響復合微生物功能的一個重要因素。不同纖維素降解菌的降解能力相差較遠，各纖維素降解菌之間存在著協同和拮抗作用，復合菌系中微生物相互作用和影響也很復雜。研究發現，復合微生物各菌株之間存在的拮抗作用，可以通過調整菌種配比來降低各個菌株間的拮抗作用[10]，因此，由2種以上的微生物構建的復合菌在制備時，都對其組合配比進行研究，例如乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌復合發酵適宜添加比例為2∶2∶2[11]；康氏木霉、白腐菌、變色栓菌與EM菌、固氮菌、解磷菌和解鉀菌組合的高效復合微生物菌劑Ⅴ的最佳配比為15∶15∶15∶25∶10∶10[12]；細菌、放線菌、酵母菌和真菌的最佳配比為3∶3∶3∶1[13]；綠色木霉、米曲霉、枯草芽孢桿菌和假單胞菌組成的復合菌，它們之間的搭配比例在2∶2∶1∶1時，效果表現較佳[14]；通過研究，CM17的最佳菌劑配比為1∶1∶1∶1。

篩選纖維素分解菌的很多研究，強調更多的是菌劑在某一特定環境條件下的功能，并不特別關注其是否具有環境廣適性：例如只研究纖維素菌在溫度為35 ℃、發酵液初始pH值為6.5時的CMCase和FPase產酶活性[15]；用4株菌進行不同組配，研究不同pH值對最佳復合菌系產酶活性的影響, 發現在偏堿性和偏酸性條件下表現出較高的酶活力[16]；以高溫期的堆肥樣品為材料，篩選構建木質纖維素分解菌復合系[17]；堆肥中木質素降解的最適溫度在40～50 ℃[18]，而嗜熱真菌的最適溫度為40～50 ℃，因此篩選嗜熱菌；為解決低溫條件下玉米秸稈降解難的問題，專門篩選低溫復合微生物菌[19]等。在堆肥過程中，環境條件變化可能對菌劑的穩定性造成影響，特別是溫度變化，酸堿度變化等這些對微生物生長影響極度敏感的因素，此外，堆肥過程中的高溫階段，溫度可達到60～70 ℃，復合菌劑在高溫下是否可以繼續發揮作用？此外堆肥的材料多種多樣，繁雜而又不穩定，整個堆肥發酵過程中不斷發生各種物理和化學變化，復合菌劑是否具有足夠的穩定性來適應這些變化和不確定的環境因素？因此研究篩選復合菌，更著重關注菌劑的環境廣適性和功能穩定性，篩選既具有環境穩定性，又有纖維素分解能力的復合菌，為此廣泛選用了20種直接來自于環境的微生物，構建25組復合菌，在不同溫度、不同酸堿度條件下研究其纖維素酶活，篩選得到CM17。青格爾等[20]對復合菌系GF-20的功能穩定性及適應性研究發現，復合菌系GF-20可在較大的溫度和pH范圍內保持較高的纖維素和半纖維素酶活性，能發揮秸稈降解作用。有研究發現復合菌會影響環境pH值，主要表現在，復合菌系對發酵液的pH值有良好的調節作用[21]；青格爾等發現發酵液pH值隨發酵時間的延長趨近于中性；復合系對環境pH的變化具有較強的緩沖調節能力，在不同初始pH的發酵環境下，其反應體系內的pH變化趨勢相似[22]；復合菌系的自我調節能力使發酵液中pH能夠恢復到中性或偏堿性[23]，有研究發現復合微生物可以改變腐解過程中溫度與水解酶活性[24]等等。而CM17的纖維素酶活功能在不同的酸堿條件下都表現出很高的穩定性。王衛東等[25]對纖維素分解菌復合系WSC-6的穩定性研究發現，在pH 4～10的范圍內，復合系對pH值具有緩沖能力，并正常分解纖維素。樸哲等發現纖維素分解菌復合系MC1的纖維素酶在65 ℃以下和pH 4.5～10.5表現出很高的穩定性，但超出此范圍，酶活性急劇下降直至喪失[26]。而CM17在35～55 ℃和pH 6～10都能正常分解纖維素，表現纖維素酶活功能具有穩定性，在制備堆肥微生物菌劑中具有良好的應用前景和潛力。

4 結 論

由鏈格孢菌、鏈霉菌、厄氏菌和短梗霉菌組合的纖維素降解菌系CM17具有良好的功能穩定性，其對溫度和酸堿的適應范圍較廣，外界溫度和酸堿變化對該復合菌功能影響較小，在35～55 ℃和pH 6～10，都能正常的分解纖維素，表現出很高的纖維素酶活功能穩定性；CM17比單菌株具有較好的纖維素分解效果，其纖維素分解效率至少是單菌株的2.33倍；該復合微生物的最佳配比為1∶1∶1∶1，在制備生物堆肥微生物菌劑中具有良好的應用前景和潛力。