腫節風內生真菌的分離鑒定及拮抗真菌篩選

宋利沙，蔣 妮，2*，藍祖栽，張占江

(1.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.廣西大學農學院，廣西 南寧 530004)

【研究意義】內生真菌是生活在植物健康組織和器官及生活史的某一特定時期、未對植物組織產生明顯病害癥狀的一類真菌，種類繁多，分布廣泛[1]。近年來的研究表明，從健康藥用植物不同組織器官中分離到的內生真菌，通過不同培養基可篩選出很多產生抑制病原真菌活性物質的內生真菌[2-5]。腫節風為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物草珊瑚[Sarcandraglabra(Thunb.) Nakai]的干燥全草，不但具有清熱涼血、活血消斑、祛風通絡等功效[6-7]，還具有抗菌消炎、抑制流感病毒、抗腫瘤、促進骨折愈合及鎮痛等多種活性成分，急性毒性試驗結果顯示無毒[8]。以腫節風為主要原料的制劑有草珊瑚含片、腫節風片、腫節風注射液和血康口服液等[9]，但迄今對腫節風內生真菌抗菌活性的研究較少。因此，分析腫節風的內生真菌多樣性，篩選具有較強抗菌活性的菌株，對尋找新型抗菌和抗腫瘤活性成分原材料具有重要意義。【前人研究進展】Supaphon等[10]從3種藥用海草中分離和鑒定了160種內生真菌，并研究其抗菌活性。Gupta等[11]研究發現姜黃(Curcumalonga)的內生真菌莖點霉菌(Phomaherbarum)具有拮抗葉斑病活性。Jin等[12]在人參中分離到兩株具有抗菌活性且可用于發酵制備人參皂苷等成分的內生真菌[PN8(Fusariumsp.)和PN17(Aspergillussp.)]；Katoch等[13]從印度芳香植物檸檬馬薄荷(Monardacitriodora)分離到28株內生真菌，分別來自11個屬，其中鐮刀菌(Fusarium)、黃曲霉(Aspergillusflavus)和Muscodor等具有開發為植物生物防治物質的潛力；Tanapichatsakul等[14]從傳統藥用植物Melodorumfruticosum的花中分離得到52株內生真菌，其中間座殼菌(Diaporthespp.)具有抗菌作用。陳娟等[15]從天山雪蓮和紅景天的根內分離到34株內生真菌，其中深色有隔內生真菌為優勢菌群；農倩等[16]報道深色有隔內生真菌對香蕉枯萎病菌具有抑制作用；譙利軍等[17]對不同地區及不同季節的健康馬比木不同組織部位樣本進行內生真菌多樣性分析，分離出1037株內生真菌，分別隸屬于30個屬，其中間殼座屬為優勢屬；元超等[18]從艾納香分離到內生真菌間殼座屬對枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)KCTC 1021具有非常強的抑制活性；鄭瑞等[19]從蛇足石杉分離到一株無盤柄盤菌(Peziculasp.)JR14，其次生代謝產物對乙酰膽堿酯酶具有抑制活性；王佳瑩[20]從金鐘花莖稈中分離到含有抗菌活性代謝產物的無柄盤菌屬內生真菌；周麗思等[21]從藥用植物丹參內生真菌中獲得1株對丹參生長和丹酚酸含量具有顯著促進作用活性的菌株；劉軍生等[22]從七葉樹(Aesculuschinensis)根和莖中分離出1株具有高產七葉皂苷C的內生真菌，其發酵液提取物具有抑菌活性；宋利沙等[23]從健康腫節風根系土壤中篩選出對腫節風炭疽病菌(Colletotrichumdematium)及14種其他植物病原真菌具有較強抑制作用的真菌。【本研究切入點】目前，對藥用植物腫節風根、莖、葉中的內生真菌進行分離、鑒定并篩選出抗菌活性強內生真菌菌株的研究未見報道。【擬解決的關鍵問題】對腫節風根、莖、葉中的內生真菌進行分離和鑒定，并篩選出抗菌活性強的內生真菌菌株，為開發新的抗菌藥物資源打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣品 于2018年10-12月，在廣西融安、都安、靖西和南寧等地采集腫節風健康植株的根、莖和葉，編號后封存于保鮮袋中，48 h內進行內生真菌分離。

1.1.2 供試指示菌 供試指示菌為病原真菌，共15種，分別為三七灰霉病菌(Botrytissp.)、三七根腐病菌(Fusariumsolani)、豆蔻葉斑病菌(Phyllostictasp.)、香蕉葉斑病菌(Alternariasp.)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、苦玄參葉斑病菌(Alternariasp.)、香蕉炭疽病菌(Colltetorrichumsp.)、香蕉枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、三七黑斑病菌(Alternariapanax)、廣西莪術葉斑病菌(Phomopsissp.)、煙草灰霉病菌(Botrytiscinerea)、三七炭疽病菌(Colltetorrichumgloeosporioides)、艾納香褐斑病菌(Phomasp.)、腫節風炭疽病菌和羅漢果葉斑病菌Stagonosporopsiscucurbitacearum，均由廣西藥用植物園植物病理研究室保存提供。

1.1.3 供試培養基 供試培養基為PDA培養基：馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 L，用于植物病原真菌培養和菌株拮抗效果測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生真菌分離和純化 采用常規組織分離法并參考Guo等[24]的方法(稍有改進)進行腫節風的根、莖和葉內生真菌分離和純化，純化后的菌株保藏于廣西藥用植物園植物病理研究室。采用超凈工作臺無菌檢測法、漂洗液的無菌檢測法和組織印跡無菌檢測法檢測表面消毒是否徹底，以確保腫節風內生真菌準確分離[25]。據菌落培養特征將分離、純化的內生真菌劃分為不同的形態類型[26]。

1.2.2 拮抗內生真菌篩選 采用平板對峙法[27]進行拮抗真菌篩選，在直徑9 cm的PDA培養基中央接種直徑5 mm的病原菌菌餅，在離菌餅2 cm的3個角點等距離接種拮抗真菌，以只接種病原菌菌餅為對照。每處理設3次重復，28 ℃恒溫培養，7 d后測定菌落生長抑制率，篩選出對病原真菌有拮抗作用的內生真菌。復篩與初篩方法相同。

菌落生長抑制率(%)=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對照菌落直徑-病原菌菌餅直徑)×100

1.2.3 內生真菌鑒定 參考方中達的方法[28]記錄菌落形態，參考魏景超的方法[29]和國際分類網站http://www.indexfungorum.org進行菌落形態初步鑒定。參考Kumar等[30]的方法，利用MEGA 7.0的鄰位連接法構建ITS rDNA系統發育進化樹，進行分子生物學鑒定：采用MightyAmp DNA Polymerase Ver.3(1.25 U/50 μl)試劑盒(Takara Bio Inc.，Japan，cat. no. R076A)，挑取培養內生真菌的菌落作為模板直接用于PCR反應，用凝膠成像法檢測目的條帶，將有目的條帶的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序；測序結果與NCBI的GenBank中的序列進行BLAST比對。

真菌種屬分類地位確定：目標序列與參考序列進行BLAST比對后，同源性≥95 %的暫定為同一個屬，相似性≥99 %的暫定為一個種。

1.2.4 內生真菌抗菌譜測定 參考1.2.2的方法進行抗菌譜測定，測量病原菌菌落的直徑和抑制率。

2 結果與分析

2.1 腫節風內生真菌的分離和純化結果

通過常規組織法分離，從健康腫節風的不同組織(根、莖和葉)分離到111株內生真菌純化培養物，其中，從莖中分離到52株(即莖的分離率占46.85 %)，葉和根分別分離到38和21株。在111株內生真菌中，從廣西南寧的材料分離純化到43株(根6株、莖22株、葉15株)，從融安的材料分離純化到18株(根4株、莖5株、葉9株)，從靖西的材料分離純化到18株(根6株、莖4株、葉8株)，從都安的材料分離純化到32株(根5株、莖21株、葉6株)，即從廣西南寧分離純化到的內生真菌最多，其次是都安，靖西和融安的最少。從111株內生真菌中選出不同形態類型菌株共42株進行分子鑒定。各菌株名編號、種類、分離器官及GenBank登錄號等信息見表1。

表1 42株腫節風內生真菌菌株的種類信息

續表1 Continued table 1

菌株編號Strain number采樣地*Collection site登錄號Accession number器官Organ種類TaxonRG-4RMK429879根毛霉亞門真菌(Mucoromycotina sp. )JJ-1JMK429850莖新殼梭孢菌(Neofusicoccum parvum)DZ-8DMK429842莖柄孢殼菌屬真菌(Podospora sp. )DZ-8-1DMK429843莖尖孢刺盤孢菌(Colletotrichum acutatum)DZ-10DMK429844莖哈銳刺盤孢菌(Colletotrichum horii)DZ-20DMK429845莖球座菌屬真菌(Guignardia vaccinii)GJ-1GMK429867莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)GJ-5GMK429868莖新殼梭孢屬真菌(Neofusicoccum brasiliense)GJ-8GMK429869莖蔥鏈格孢(Alternaria porri)GJ-8-2GMK429874莖暗色擬莖點霉(Diaporthe vaccinii)GJ-9GMK429870莖間座殼屬真菌(Diaporthe pseudomangiferae)GJ-11GMK429871莖間座殼屬真菌(Diaporthe eugeniae)GJ-14GMK429872莖多主棒孢霉(Corynespora cassiicola)GJ-15GMK429873莖高粱附球菌(Epicoccum sorghinum)RJ-1RMK429861莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)RJ-2RMK429862莖橡膠生擬莖點霉(Phomopsis heveicola)RJ-3RMK429863莖擬莖點霉屬真菌(Phomopsis sp. )RJ-5RMK429864莖擴散炭墊菌(Nemania diffusa)RJ-6RMK429865莖間座殼屬真菌(Diaporthe hongkongensis)

注：*采樣地中的D代表都安縣，G代表南寧(廣西藥用植物園)，J代表靖西縣，R代表融安縣。

Note:*Collection locations，D stands for Du'an County，G stands for Nanning(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants)，J stands for Jingxi county，and R stands for Rongan county.

2.2 基于ITS序列分析內生真菌的分類地位

經PCR擴增和測序，42株不同形態類型腫節風內生真菌的ITS序列與GenBank中的41株真菌參考序列(表2)相似性在99 %以上，分屬于3門9目20屬28種，其中，JY-8菌株鑒定到盤菌綱水平，DY-8鑒定到目水平，DY-5鑒定到炭角菌科水平，RG-4鑒定到毛霉亞門水平，DZ-8、RJ-3、JY-3和JG-1鑒定到屬水平，分別鑒定為柄孢殼菌屬(Podosporasp.)、擬莖點霉屬(Phomopsissp.)、多節孢屬(Nodulisporiumsp.)和被孢霉屬(Mortierellasp.)。

基于ITS rDNA序列構建的腫節風內生真菌系統發育進化樹(圖1)顯示，42株內生真菌分屬于10個分支，并有很高的支持率。JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4個菌株屬于糞殼菌綱(Pezizomycotina)亞門黑孢菌屬的種，與Nigrosporasphaerica和Nigrosporaoryzae等菌株相似率在99 %以上；JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5個菌株屬于糞殼菌綱炭角菌目(Xylariales)不同屬的種，JG-2鑒定為光輪層炭殼菌(Daldiniaeschscholtzii)，RY-3鑒定為草莓狀炭團菌(Hypoxylonfragiforme)，DY-3和RJ-5鑒定為Nemaniadiffusa，其中除GG-4與Xylariaberteri相似率達99 %外，其他菌株與所對應種的相似率均達100 %；GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3個菌株屬于糞殼菌綱(Glomerellales)目刺盤孢屬的種，GY-13和DZ-8-1分別鑒定為Colletotrichumboninense和Colletotrichumacutatum，DZ-10鑒定為哈銳炭疽菌(Colletotrichumhorii)，相似率均達100 %；RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9個菌株屬于糞殼菌綱間座殼目(Diaporthales)中的無性世代擬莖點霉屬和間座殼屬不同的種，RY-2、GJ-1、RJ-2和RJ-1等4個菌株鑒定為橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)，GYB-1鑒定為Diaporthephaseolorum，RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等4個菌株分別鑒定為Diaporthevelutina、Diaporthevaccinii、Diaporthehongkongensis和Diaporthepseudomangiferae，相似率均達100 %；JG-4屬于糞殼菌綱糞殼菌目(Sordariales)毛殼菌屬的種，與Chaetomiumcupreum的相似性達100 %，鑒定為Chaetomiumcupreum；DZ-20、JJ-1和GJ-5等3個菌株屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)球座菌屬和殼梭孢屬的種，與對應種GuignardiavacciniiFJ538353、NeofusicoccumparvumEU650672和NeofusicoccumbrasilienseMH809527的相似率達100 %，分別鑒定為G.vaccinii、新殼梭孢菌(N.parvum)和N.brasiliense；GJ-14、GJ-15和GJ-8等3個菌株屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)格孢腔目(Pleosporales)棒孢菌屬、附球菌屬和鏈格孢屬不同的種，分別鑒定為Corynesporacassiicola、Epicoccumsorghinum和Alternariaporri；DY-6和DY-7分別鑒定為Leptosporarubella和Paraphomachrysanthemicola；JG-1屬于接合菌門(Zygomycota)毛菌綱毛霉目被孢霉科被孢霉屬，屬于Mortierellasp.，相似率均達100 %。

表2 參與系統分析的內生真菌菌株種類、寄主、來源和登錄號

注：— 表示無數據。

Note:— represented no data.

Bootstrap values was more than 50 % support from 1000 re-samplings. Gaertneriomyces semiglobiferus AY997051 was used as outgroup圖1 基于ITS rDNA序列構建的腫節風內生真菌系統發育進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi of S. glabra based on ITS rDNA region sequences

從圖1可看出，優勢菌群RY-2、GJ-1、RJ-2、RJ-1、GYB-1、RY-4、GJ-8-2、RJ-6和GJ-9等9個菌株屬于糞殼菌綱間座殼目(Diaporthales)中的無性世代擬莖點霉屬(Phomopsissp.)和間座殼屬(Diaporthesp.)的不同種；其次屬于糞殼菌綱炭角菌目Xylariales不同屬的種有JG-2、RY-3、GG-4、DY-3和RJ-5等5個菌株；屬于黑孢菌屬Nigrosporasp.的不同種有JY-6、GY-12、GY-2和JY-9等4個菌株；分屬于刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)的不同種有GY-13、DZ-8-1和DZ-10等3個菌株。

2.3 內生真菌的抗菌活性測定結果

以廣西藥用植物園植物病理研究室所保存的15種病原真菌為指示菌，采用平板對峙法對111株腫節風內生真菌進行抗菌活性測定，經初篩和復篩發現，只有RJ-1和JJ-1對15種病原真菌有較高的抗性，抑制率在60 %以上(表3)。其中RJ-1和JJ-1菌株對三七灰霉病菌、三七根腐病菌、三七炭疽病菌、香蕉炭疽病菌、艾納香褐斑病菌、苦玄參葉斑病菌和腫節風炭疽病菌等7種病原菌的抑制率均在80 %以上，具有強的抑菌廣譜性。

表3 拮抗真菌的抑菌譜

注：++++：菌落生長抑制率60 %～69 %；+++++：菌落生長抑制率70 %～79 %；++++++：菌落生長抑制率>80 %。

Note:++++：Colony growth inhibition rate 60 %-69 %；+++++：Colony growth inhibition rate 70 %-79 %；++++++：Colony growth inhibition rate>80 %.

3 討 論

本研究對廣西不同地區健康腫節風不同組織的內生真菌進行分離和鑒定，得到111株內生真菌，選出其中的42個不同形態類型分屬于9目20屬的不同種，表明腫節風中具有豐富的內生真菌資源，與郭順星[1]研究指出內生真菌存在于不同植物中并與宿主植物長期協同進化、互利共生的觀點一致。許多內生真菌不僅從宿主植物吸取營養物質供給自身生長發育需要，而且還可提高宿主植物對環境脅迫的抗性，如抗病蟲害和抗干旱性等[1]。從健康腫節風植株不同組織中分離得到的擬莖點霉屬(Phomopsis)和交鏈孢屬(Alternaria)常被認為是植物的病原真菌[31-32]，然而近年來的研究表明，此2個屬所產生的次生代謝產物具有抑菌和防蟲作用[32-33]，有利于協助宿主植物抵御病原菌和不良生長環境。植物內生真菌菌群在宿主植物中的組成和生態分布特征隨著組織類型、季節、降水量、溫度、宿主樹齡、光照和營養成分等眾多因素的改變而變化[31-34]，植物內生真菌與宿主間是一種動態平衡的進化過程，彼此發揮著重要的生態學功能。綜上所述，內生真菌也產生具有生物活性的次生代謝產物，可為開發新的抗菌藥和化合物提供重要依據。

本研究對111株內生真菌進行抑菌活性測試，獲得具有較高活性、對多種病原真菌具有抑制作用的RJ-1和JJ-1菌株，分別鑒定為橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)和新殼梭孢菌(Neofusicoccumparvum)，具有一定的潛在生防應用價值。已有研究表明，橡膠生擬莖點霉(Phomopsisheveicola)和新殼梭孢菌是橡膠幼樹和柏木枯萎病的病原真菌[35-36]，而在本研究中屬于內生真菌，通過回接到健康腫節風的不同組織，未出現致病現象，與Aly等[31]研究報道內生真菌寄生到健康植物上受到環境脅迫時會引起植物發病而變成病原菌、內生真菌與宿主植物呈動態平衡拮抗關系的觀點不一致，有待對病原菌與內生真菌的轉換關系進行探究后才能明確原因。RJ-1和JJ-1菌株的抗菌活性物質代謝產物、發酵工藝優化及其對植物生長的影響也需進行系統探討。

4 結 論

腫節風存在豐富的內生真菌物種，從中篩選出的RJ-1和JJ-1菌株對15種病原真菌具有較強的抑制作用，可作為抗菌活性菌株開展深入研究。