利用CRISPR/Cas9技術敲除轉基因水稻中的潮霉素標記基因

彭梅芳，甘 鳳，潘春梅，宋健蘭，范曉麗，陳克貴

(四川省農業科學院生物技術核技術研究所，四川 成都 610061)

【研究意義】在植物基因工程中，通常將目標基因(Gene of Interest, GOI)表達元件與適宜的選擇標記基因(Selectable Marker Gene, SMG)構建到同一載體上，一起轉入植物細胞，然后借助SMG篩選轉化細胞，進一步培育轉基因植株[1]。通過這種方法得到的轉基因植株中SMG會隨著GOI一起整合到宿主植物基因組中，而常用的SMG編碼的蛋白通常是抗生素或除草劑類，SMG殘留可能對人畜等食物鏈下游生物產生不良影響，特別是對人體健康存在潛在危害，這也是轉基因生物安全性一直備受爭議的主要原因[2]；此外，目前可利用的SMG數量有限，利用相同的SMG，對植物多次導入GOI存在一定困難，阻礙了多次轉化達到基因聚合的目的[3]。并且我國轉基因生物安全管理也要求無標記基因的存在。因此，無論從轉基因生物安全性考慮，還是從基因工程技術的更廣泛應用考慮，去除轉基因作物中的SMG都十分必要。 【前人研究進展】基因組編輯是指利用人工序列特異核酸酶(Sequence-specific nucleases, SSNs)在基因組特定位點產生DNA雙鏈斷裂(Double-strand breaks, DSBs)，實現對基因靶位點的敲除、染色體的重組以及基因的定點插入或替換等，是對基因組進行定向修飾的一種技術。根據所采用的人工核酸內切酶不同，基因組編輯技術主要經歷了三代發展：即鋅指核酸酶(Zinc finger nucleases, ZFNs)[4]技術、類轉錄激活子樣效應因子核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)[5]技術、成簇的、規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)及其相關核酸酶9系統(CRISPR-associated 9, Cas9)[6]。CRISPR/Cas9系統自2013年初建立以來[7-8]，因其具有操作簡單、作用高效、成本低廉等優點，迅速成為基因組改造與修飾的重要工具。目前已成功應用于各種細菌、動物及植物的基因組精確修飾中，被認為是最具有廣闊應用前景的一種基因組定點編輯技術。【本研究切入點】本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，針對水稻轉基因中常用的SMG潮霉素抗性基因(hygromycinphosphotransferaseII,hptII)進行基因編輯。【擬解決的關鍵問題】期望獲得刪除hptII基因的轉基因水稻，獲得marker-free的轉基因水稻。

1 材料與方法

1.1 植物材料

受體材料為野生型水稻(OryzasativaL.)品種日本晴(Nipponbare)，由四川省農業科學院生物技術核技術研究所基因與基因技術實驗室保存。含hptII基因的轉基因水稻品種日本晴由四川省農業科學院生物技術核技術研究所基因與基因技術實驗室獲得(轉化質粒為pCXUN)。

1.2 菌株與質粒

農桿菌LBA4404由四川省農業科學院生物技術核技術研究所基因與基因技術實驗室保存。質粒pYLsgRNA-OsU6a(GenBank登錄號：KR029105)、pYLsgRNA-OsU3(GenBank登錄號：KR029103)和質粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B由華南農業大學劉耀光教授惠贈。質粒pCXUN(GenBank登錄號：FJ905215)由中國農業科學院植物保護研究所王國梁研究員惠贈。

1.3 主要酶及試劑

質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒和RNA提取試劑盒均購自于天根生化科技有限公司；PrimeSTAR max DNA Polymerase、反轉錄試劑盒、pMD19-T載體購自TakaRa公司；普通PCRmix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BsaI內切酶購自于New England Biolabs(NEB)公司；T4DNA 連接酶購自MBI Fermentas公司；CTAB、氯仿、異戊醇、異丙醇等常規化學試劑購自上海生工生物工程有限公司；PCR產物測序和引物合成由成都擎科梓熙生物技術有限公司完成。

1.4 CRISPR/Cas9編輯載體構建

根據sgRNA的設計原理，以pCXUN載體中的hptII基因序列為目標序列，通過在線網站CRISPR RGEN Tools(http://www.rgenome.net/cas-designer/)設計hptII基因的sgRNA，選擇2個sgRNA作為基因編輯位點，具體sgRNA設計和載體構建主要參照華南農業大學劉耀光教授的方法[9]。

1.4.1 OsU6a+sgRNA-1表達盒的克隆 sgRNA-1目標序列為CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG。第一輪PCR擴增：以U-F+OsU6aHy-1，gRHy-1+gR-R分別各為一對引物(表1)，以pYLgRNA-OsU6a質粒為模板，用高保真酶PrimeSTAR進行PCR擴增，分別獲得片段1和2。第二輪PCR擴增：以第一輪擴增回收的1和2產物混合作為模板，以Pps-GGL和Pps-GG2-1為引物(表1)，PCR獲得帶BsaI酶切位點的DNA片段，該片段經BsaI酶切后得第一個表達盒OsU6a+sgRNA-1。

1.4.2 OsU3+sgRNA-2表達盒的克隆 sgRNA-2目標序列為ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG。第一輪PCR擴增：以U-F+OsU3Hy-2，gRHy-2+gR-R分別各為一對引物(表1)，以pYLgRNA-OsU3質粒為模板，用高保真酶PrimeSTAR進行PCR擴增，分別獲得片段3和4。第二輪PCR擴增：以第一輪擴增回收的3和4產物混合作為模板，以Pps-GG2-2和Pgs-GGR為引物(表1)，擴增獲得帶BsaI酶切位點的DNA片段。該片段經BsaI酶切后得到第二個表達盒OsU3+sgRNA-2。

1.4.3 sgRNA表達盒連入編輯載體 質粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B經BsaI酶切回收載體大片段，與經BsaI酶切后的2個表達盒OsU6a+gRNA-1、OsU3+gRNA-2進行連接，最終獲得編輯hptII基因的載體質粒，命名為PMF117。將PMF117轉入農桿菌LBA4404中，用于水稻遺傳轉化。

表1 本研究所用引物

注：ggtctc為BsaI識別位點；ACTAGT為SpeI酶切位點；ACGCGT為MluI酶切位點。

Notes: ggtctc is theBsaI digestion recognition site; ACTAGT is theSpeI digestion recognition site; ACGCGT is theMluI digestion recognition site.

1.5 農桿菌介導的水稻遺傳轉化

日本晴遺傳轉化步驟參照Nishimura等[10]的方法，具體地將野生型水稻日本晴種子經75 %無水乙醇、0.1 %升汞消毒處理后誘導成愈傷組織，然后用農桿菌去侵染愈傷組織，經篩選、分化等步驟得到再生植株。

1.6 T0代轉基因陽性苗鑒定及cas9表達分析

經雙丙胺膦篩選得到的抗性植株，即為T0代轉化植株。通過CTAB法提取T0代植株基因組DNA，分別用引物F-Barr+R-Barr和SP-L1+SP-R(表1)進行PCR擴增，2對引物均檢測為陽性的植株，即為所需要的轉基因陽性植株。進一步對陽性植株提取RNA，反轉錄成cDNA，用引物F-Lcas9-RT+R-Lcas9-RT(表1)進行RT-PCR檢測Cas9基因表達情況。Cas9基因表達陽性的植株經兩代篩選獲得可用于編輯hptII基因的純合株系。

1.7 敲除轉基因水稻中的hptII基因

將獲得的編輯hptII基因的水稻與含有hptII基因的轉基因水稻進行雜交，雜交F1代種子萌發，分單株提取幼葉基因組DNA，用潮霉素抗性基因特異引物F-HPTII-542和啟動子引物R-35S-P(表1)進行PCR擴增，PCR產物送測序，測序為雙峰的即是hptII基因有被編輯的植株。進一步將測序為雙峰的PCR產物與T載體pMD19-T連接，進行亞克隆，挑取單克隆進行測序分析hptII基因ORF區序列情況，確定hptII基因是否被敲除。

2 結果與分析

2.1 sgRNA靶點設計和表達盒擴增

以pCXUN載體(GenBank登錄號：FJ905215)中的hptII基因序列設計了2個sgRNA的靶位點。sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’(正向)；sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’(反向)。其中sgRNA-1用OsU6a作為啟動子，經重疊PCR擴增得到OsU6a+sgRNA-1表達盒的片段長度為629 bp；sgRNA-2用OsU3作為啟動子，PCR擴增得到OsU3+sgRNA-2表達盒的片段長度為603 bp(圖1)。

2.2 CRISPR/Cas9基因編輯工程菌的獲得

將OsU6a+sgRNA-1和OsU3+sgRNA-2表達盒片段回收后，與質粒pYLCRISPR/Cas9Pubi-B(華南農業大學劉耀光教授惠贈，GenBank登錄號：KR029110)一起用BsaI 和T4DNA 連接酶進行酶切連接反應，轉化大腸桿菌DH5а，經PCR鑒定陽性克隆送測序，結果表明OsU6a+sgRNA-1和OsU3+sgRNA-2表達盒均準確連入載體pYLCRISPR/Cas9Pubi-B中，命名為PMF117(圖2)。將PMF117轉化農桿菌LBA4404即獲得編輯hptII基因的工程菌。

M：DNA marker (DL2000)； 1：OsU6a+sgRNA-1表達盒；2：OsU3+sgRNA-2表達盒M: DNA marker (DL2000); 1: OsU6a+sgRNA-1 expression box; 2: OsU3+sgRNA-2 expression box圖1 sgRNA 表達盒PCR擴增圖Fig.1 PCR amplification of sgRNA expression box

2.3 水稻T0代轉基因植株的獲得及鑒定

采用農桿菌介導的方法，將PMF117轉化到水稻品種日本晴中，得到25株T0代轉化植株，分別提取基因組DNA，進行PCR鑒定，其中23株Bar基因和sgRNA表達盒均檢測為陽性(圖3)，陽性率達92 %。進一步對23株陽性植株提取RNA，反轉錄成cDNA，檢測Cas9基因表達情況，結果表明有18株轉基因植株中Cas9基因表達為陽性(圖4)，證明PMF117成功轉入水稻植株中，并且Cas9基因得到了表達。

1～6：不同的T0代轉基因株系；N：野生型日本晴1-6: Transgenic T0 plantlets; N: Wild type Nipponbare圖4 不同轉基因植株的Cas9基因轉錄水平的RT-PCR分析Fig.4 RT-PCR analysis of Cas9 gene transcript in the transgenic plantlets

2.4 hptII基因編輯材料的獲得及鑒定

T0代轉基因陽性植株再經兩代篩選獲得純合的、穩定表達Cas9基因和sgRNA的轉基因植株，即獲得可以編輯hptII基因的轉基因純合植株。將得到的編輯hptII基因的水稻植株與含有hptII基因的水稻植株進行雜交，CRISPR/Cas9系統即可在雜交F1代植株中對hptII基因的DNA進行編輯剪切。用引物F-HPTII-542和R-35S-P對F1代植株DNA進行hptII基因擴增，PCR產物直接測序分析。結果表明，9株F1代植株中有6株的PCR產物測序在設計的sgRNA位點附近出現明顯雙峰(圖5)，初步確認這6株F1代植株的hptII基因有被編輯，編輯率為66.67 %。進一步，將測序為雙峰的PCR產物與T載體連接，進行亞克隆，挑取單克隆進行測序，結果表明在F1代植株中hptII基因的ORF區有堿基缺失(1～43 bp)、替換以及單堿基插入(圖6)，使得hptII基因不能成功翻譯。這些編輯的F1代植株通過自交得到F2代，在F2代中篩選可得到hptII基因DNA缺失、不能翻譯出HPTII抗性蛋白，并且不含編輯載體等外源片段的植株，即得到成功敲除轉基因水稻中的潮霉素標記基因的植株。

圖2 PMF117質粒Fig.2 PMF117 vector

A：轉基因植株的Bar基因PCR檢測；B：轉基因植株的sgRNA表達盒PCR檢測；M：DNA marker (DL2000)；P：PMF117質粒；N：野生型日本晴DNA；1～6：不同的T0代轉基因株系A: PCR detection of Bar gene; B: PCR detection of sgRNA expression box; M: DNA marker (DL2000); P: PMF117 plasmid; N: Wild type Nipponbare DNA; 1-6: Transgenic T0 plantlets圖3 轉基因植株的PCR檢測Fig.3 PCR detection of transgenic plantlets

圖5 F1代植株的PCR產物測序結果Fig.5 Sequencing results of PCR products from F1 generation plants

A：sgRNA-1靶位點的突變序列比對；B：sgRNA-2靶位點的突變序列比對；G、J、H：不同的F1代植株A: DNA sequence alignment of sgRNA-1 target site; B: DNA sequence alignment of sgRNA-2 target site; G，J,H: Different F1 generation plants圖6 亞克隆中 hptII基因靶位點突變序列比對Fig.6 DNA sequence alignment of hptII gene target site in subclone

3 討 論

在植物遺傳轉化中，SMG起著非常重要的作用，可以幫助更準確快捷地得到轉化子，但當轉化完成后，SMG就失去了其使用價值。相反，在轉基因植物中，SMG的存在被認為可能對人類健康和生態環境存在潛在的危害。隨著轉基因作物商業化進程的快速發展，無SMG轉基因植物的研究和培育已成為國際上植物基因工程領域的一個趨勢。目前，刪除SMG的常用方法主要有：共轉化系統法、DNA位點特異性重組系統法、轉座子系統法、同源重組法和多元自主轉化載體系統法[11]。利用這些方法在水稻[12-13]、玉米[14]、大豆[15]、柑橘[16]等作物研究上都成功實現了刪除SMG。經過這么多年的發展，刪除SMG的技術也在不斷發展完善中，但目前這些技術大多處于實驗室研究領域，且每種方法都存在著一定的局限性。因此簡單快捷高效地刪除SMG技術的開發和應用，仍然是國內外轉基因研究領域的一項重要課題。

CRISPR/Cas9技術自2013年初建立以來，被認為是一種相比ZFN和TALEN操作更簡單快捷、作用更高效準確的基因組編輯技術。目前已成功廣泛應用于玉米[17]、水稻[18-20]、小麥[21-22]、大豆[23-24]、番茄[25]等作物轉基因研究中，編輯效率有的甚至可以達到100 %。本研究利用CRISPR/Cas9技術，針對水稻轉基因中常用的SMGhptII基因進行敲除。首先將構建的用于編輯hptII基因的編輯載體轉入野生型水稻日本晴中，篩選獲得Cas9表達的純合株系；再將得到的編輯hptII基因的水稻純合植株與含有hptII基因的轉基因水稻植株進行雜交，在雜交F1代植株中即獲得了hptII基因被敲除的植株。進一步，F1代植株通過自交得到F2代，在F2代中篩選可得到hptII基因DNA缺失、不能翻譯出HPTII抗性蛋白，且不含有用于進行編輯hptII基因所轉入水稻植株的外源DNA的植株，可以得到徹底刪除轉基因水稻中的hptII基因和其他非目的基因的外源片段的植株。

4 結 論

利用CRISPR/Cas9技術，成功獲得了可用于敲除水稻轉基因中hptII基因的轉基因水稻，利用該水稻與含hptII基因的轉基因水稻雜交，即可得到敲除hptII基因的水稻。利用該方法可在轉化完成后才刪除SMG，具有簡單、通用的特點。