靈芝多糖肽對肝癌細胞Huh7活性、遷移和細胞凋亡的影響

黃在興，劉凌云，陳 華，翁伯琦，林占熺，劉朋虎*

(1. 福建農林大學生命科學學院/福建農林大學國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；2.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；3. 福建省農業(yè)科學院，福建 福州 350002)

【研究意義】肝癌是位列世界第六大最常見的癌癥，也是全球癌癥死亡的第四大原因[1]。肝癌中約90 %為肝細胞型肝癌(HCC)[2]， HCC的極強局部擴散和遠處轉移能力是其術后高復發(fā)的重要原因[3-4]，也是導致癌癥患者死亡的重要原因[5]。目前，HCC臨床治療主要有手術切除、化療、化學藥物治療、分子靶向治療等，以上治療方式存在治療效果不佳、價格昂貴、副作用大等缺點。近年來，因中草藥具有藥效明顯、副作用小、價格低廉等特點，其抗腫瘤實驗研究是當今的熱點。【前人研究進展】靈芝為擔子菌綱(Polyporales)多孔菌科(Polyporaceae)靈芝屬(GanodermaKarst.)，是我國法定藥材之一[6]。靈芝多糖肽(Ganoderma lucidum polysaccha—rides peptide，GL-PP)作為靈芝重要活性成分之一[7-8]，具有抗氧化和損失保護作用[9-12]，Kim[13]從靈芝提取到一種蛋白多糖，并證明該蛋白多糖對小鼠S-180肉瘤有明顯的抑制作用。目前，對靈芝抗腫瘤、調節(jié)免疫的作用多集中在靈芝多糖上[14-17]，而有關靈芝多糖肽抗腫瘤作用的報道較少。【本研究切入點】本研究用GL-PP處理人肝癌細胞Huh7，分析GL-PP對離體肝癌細胞活性，細胞遷移能力和細胞凋亡的影響。【擬解決的關鍵問題】為揭示靈芝多糖肽抗腫瘤機制及其應用于肝癌治療提供理論依據。

表1 主要藥品與儀器

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌草靈芝多糖肽由福建農林大學國家菌草工程技術研究中心林樹錢教授提供(赤芝子實體用蛋白酶酶解后醇提取獲得)；肝癌細胞株Huh7由福建醫(yī)科大學孟超肝膽醫(yī)院提供；本實驗所需其他主要藥品與儀器如表1所示。

1.2 實驗方法

1.2.1 GL-PP對肝癌細胞活性的影響 在96孔板中接種5000個肝癌細胞和正常的肝臟細胞，用100 μl不同濃度的GL-PP溶液(0, 50, 100, 200 μg/mL)培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，放置在培養(yǎng)箱(37 ℃，5 % CO2)中過夜； 24 h后換液，向每孔加入100 μl含10 μl CCK8溶液的細胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h；培養(yǎng)結束后，在多功能酶標儀上測定450 nm處的吸光度。

按如下公式計算細胞活力：細胞活力(100 %)=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)。

1.2.2 GL-PP對肝癌細胞遷移的影響 用不同濃度的GL-PP溶液(0, 100, 200 μg/mL)培養(yǎng)肝癌細胞，24 h后收集細胞并制備細胞懸液；在8 μm規(guī)格的Transwell小室濾膜上加入10萬個細胞，用100 μl含0.5 μl BSA的DMEM細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在下層加入600 μl含10 %胎牛血清(加相應濃度的多糖)的DMEM細胞培養(yǎng)基；培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，棄孔中的培養(yǎng)液，用無鈣的PBS緩沖液沖洗2遍，再用甲醇固定30 min，將小室適當風干。等風干后，用濃度為0.1 %的結晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，再用PBS緩沖液沖洗3遍，最后放置在400倍顯微鏡下觀察上室內細胞遷移情況。

1.2.3 GL-PP對肝癌細胞凋亡的影響 在24孔板中接種5萬個肝癌細胞，待細胞生長到80 %匯合率時，加入不同濃度的GL-PP溶液(0、50、100、200 μg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)過夜；24 h后，收集細胞，用PBS緩沖液沖洗2次， 300 g 離心5 min；用100 μl 1×Annexin V binding solution重懸細胞，向細胞懸液中加入5 μl Annexin V-FITC結合物，再加入5 μl PI solution。混合均勻后，室溫下避光孵育15 min并不時振蕩；孵育結束后，加入200 μl 1×Annexin V binding solution并進行流式細胞儀分析。

1.2.4 數據處理 數據整理采用Microsoft Excel，差異性分析采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件，繪圖采用GraphPad Prism，用FlowJo軟件對肝癌細胞凋亡情況進行分析。

2 結果與分析

2.1 GL-PP對肝癌細胞活性的影響

本實驗研究了不同濃度GL-PP(0～200 μg/mL)對肝癌細胞活性的影響(圖1)，實驗結果顯示，隨培養(yǎng)基里的GL-PP濃度的增加，培養(yǎng)得到的肝癌細胞Huh7的細胞活性略微下降，且濃度越高活力下降越多，但差異性不顯著，說明本試驗濃度范圍內，GL-PP對肝癌細胞Huh7活力影響不大。

2.2 GL-PP對肝癌細胞遷移的影響

Transwel細胞遷移實驗結果如圖2所示， 中濃度(100 μg/mL)的GL-PP，相比對照組(CK)的肝癌細胞遷移數量明顯減少，高濃度(200 μg/mL)的GL-PP，相比中濃度(100 μg/mL)肝癌細胞的遷移數量明顯下降，以上結果表明在濃度0～200 μg/mL范圍內，GL-PP隨著濃度的增加對肝癌細胞的遷移抑制效果越來越明顯，具有一定的量效關系。

2.3 GL-PP對肝癌細胞凋亡的影響

本研究用不同濃度的GL-PP溶液處理肝癌細胞，用FlowJo軟件進行分析，得到熒光雙染色二維點圖如圖3所示， Q1表示(AnnexinV-FITC)-/PI+，此區(qū)域的細胞為壞死細胞，也可能有少數的晚期凋亡細胞在其中，甚至機械損傷的細胞也包含其中；Q2表示(AnnexinV+FITC)-/PI+，此區(qū)域的細胞為晚期凋亡細胞；Q3表示(AnnexinV-FITC)+/PI-，此區(qū)域的細胞為早期凋亡細胞；Q4表示(AnnexinV-FITC)-/PI-，此區(qū)域的細胞為活細胞。統(tǒng)計細胞凋亡率的方法通常采用Q2+Q3。

根據熒光染色二維點圖，對凋亡率的差異性進行分析，結果如表2所示，當添加的GL-PP濃度為50和100 μg/mL時，培養(yǎng)得到的肝癌細胞Huh7的凋亡率和空白對照(0 μg/mL)相比沒有明顯的差異，顯著性不差異(P>0.05)；當添加GL-PP的濃度達到200 μg/mL時，肝癌細胞Huh7的凋亡率明顯上升，并且差異顯著(P<0.05)，說明高濃度(200μg/mL)的GL-PP對肝癌細胞Huh7的凋亡有明顯的誘導作用。

圖1 不同濃度GL-PP對肝癌細胞Huh7活力影響Fig.1 Effects of different concentrations of GL-PP on the viability of Huh7 cells

3 討 論

肝癌細胞的極強侵襲和轉移是肝癌復發(fā)的重要原因[18]，探索防止肝癌復發(fā)的有效干預策略是增加患者生存率的關鍵[19]。近年來，隨著中草藥抗腫瘤研究的深入，靈芝三萜化合物[20]、靈芝孢子粉[21]、靈芝孢子油[22]、靈芝酸[23]、靈芝多糖[24-25]、靈芝肽[26-27]等被相繼報道能有效抑制肝癌細胞遷移、增殖或誘導肝癌細胞凋亡。本研究探討了不同濃度的GL-PP對肝癌細胞Huh7的活性、遷移和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)隨著GL-PP濃度的增加肝癌細胞Huh7活性越來越低，這表明GL-PP在0～200 μg/mL濃度范圍內對肝癌細胞Huh7的活性有一定的影響，但差異性不顯著(P>0.05)。GL-PP對肝癌細胞Huh7的遷移具有明顯的抑制作用，這與曹琦珍[28]的研究結果(靈芝多糖肽處理的血清能夠有效抑制人肺癌細胞的增殖)相似，而腫瘤的侵襲和遷移是一個復雜的生物學過程，每個階段可以通過基因或者信號通路來調控[29]，靈芝多糖肽抑制肝癌細胞Huh7遷移的具體機制需進一步深入研究。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)低濃度(0～100 μg/mL)GL-PP對肝癌細胞Huh7的凋亡無明顯誘導作用，但高濃度(200μg/mL)的GL-PP能夠明顯誘導肝癌細胞Huh7凋亡(P<0.05)。有研究[30]報道靈芝多糖GL-B在小鼠體內能增加腫瘤壞死因子α(TNF-α)和干擾素γ(IFN-γ)使腫瘤細胞凋亡，劉媛[14]的研究表明靈芝多糖還可通過增加NK細胞的活性來刺激TNF-α和IFN-γ的釋放，最終達到抗腫瘤作用。也有報道[31]證明靈芝多糖可阻滯人肝癌HepG2細胞于G0/G1期，并可誘導其凋亡，靈芝肽可使細胞內Ca2+超載從而誘導HepG2細胞凋亡，同時還可以促使Bcl-2和survivin基因下調表達以及 p53基因上調表達，激活Caspase-3活性。因此，GL-PP在誘導肝癌細胞凋亡的機理是否與靈芝多糖或靈芝肽相同或相似也是值得深入研究的方面。

圖2 不同濃度GL-PP對肝癌細胞Huh7遷移的影響Fig.2 Effects of different concentrations of GL-PP on migration of Huh7 cells

A:對照組CK； B、C、D圖中GL-PP添加濃度分別為50,100,200 μg/mL圖3 不同濃度的GL-PP對肝癌細胞Huh7凋亡的影響Fig.3 Effects of different concentrations of GL-PP on apoptosis of Huh7 cells

表2 不同濃度GL-PP影響下肝癌細胞Huh7凋亡率的變化

注：同列數據后不同小寫字母表示不同處理之間的差異顯著(P<0.05)。

綜上所述，本研究證明了GL-PP能夠抑制肝癌細胞Huh7的遷移，高濃度的GL-PP可明顯誘導Huh7的凋亡， GL-PP對Huh7的活性影響不顯著，但GL-PP 對Huh7的作用機制尚未清楚，這是今后研究的努力方向，本次研究結果可為揭示GL-PP對肝癌作用機制提供基礎依據，為用于肝癌輔助治療提供科學依據。