青藏高原牦牛支原體血清抗體檢測及流行趨勢研究

王冬經(jīng)，徐業(yè)芬，嚴明帥，索朗斯珠，趙霞玲，參木友，朱 勇，牛家強*

(1.西藏農(nóng)牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000；2.西藏農(nóng)牧學院 西藏高原動物疫病研究自治區(qū)校重點實驗室，西藏 林芝 860000；3.西藏農(nóng)牧科學院草原研究所，西藏 拉薩 850000；4.西藏農(nóng)牧科學院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850000)

【研究意義】牦牛是我國青藏高原高寒缺氧地區(qū)的特色畜種和優(yōu)勢畜種，屬于肉、乳、毛、使役兼用的品種，主要分布在我國西藏、青海、四川、甘肅、云南等地[1]。由于牦牛多生活在海拔較高的高山地帶，氣候寒冷多風，晝夜溫差大等，牛呼吸性疾病成為影響我國牦牛產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的重要疾病。牛支原體(Mycoplasmabovis)可引發(fā)牛肺炎、乳房炎、生殖道炎、耳炎等多種疾病，給養(yǎng)牛業(yè)業(yè)造成了不可估量的損失[2]。【前人研究進展】據(jù)資料顯示，牛支原體可感染奶牛、肉牛、牦牛、水牛，通常不感染人[3-4]。目前有關我國甘肅、青海、四川、西藏等地牦牛支原體感染的全面調(diào)查和系統(tǒng)性分析資料還未見報道。【本研究切入點】為了探明我國青藏高原牦牛支原體的感染狀況及流行趨勢，本文對我國牦牛數(shù)量最多、分布最廣的西藏地區(qū)進行了牦牛支原體流行病學調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)，西藏牦牛支原體感染率竟已高達46.10 %(201/436)[5]，且呈現(xiàn)出逐年上升趨勢。【擬解決的關鍵問題】對來自四川、甘肅、青海的牦牛群進行牛支原體血清抗體檢測，初步研究目前牛支原體病在我國牦牛群中的流行情況，分析其流行趨勢。

1 材料與方法

1.1 血清來源

從四川、甘肅、西藏、青海采集牦牛血液959 份(其中四川56 份；甘肅243 份；西藏436 份；青海224 份)。試驗采用一次性使用靜脈血樣采集針和一次性使用真空采血管采集牦牛全血，血液采集后冷藏運輸至實驗室，4000 r/min，離心時間5 min，吸取上層的血清，分裝后置于-20 ℃保存，檢測前取出，置于室溫下解凍。

1.2 主要試劑

牛支原體抗體ELISA檢測試劑盒(批號為CK-D77383)購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

本試驗所用一次性使用靜脈血樣采集針(購自山東省成武縣醫(yī)用制品廠)、一次性使用真空采血管(購自江蘇宇力醫(yī)療器械有限公司)、恒溫培養(yǎng)箱(購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)、自動酶標儀(購自深圳雷杜生命科學股份有限公司)、超純水機(購自成都超純科技有限公司)及微量移液器(購自賽伯樂(上海)儀器有限公司)均由西藏農(nóng)牧學院西藏高原動物疫病研究自治區(qū)高校重點實驗室提供。

1.4 ELISA檢測

本研究所檢血清樣品均采用牛支原體抗體(MCP-Ab)ELISA檢測試劑盒進行檢測，試驗操作嚴格按照試劑盒說明書要求進行。

1.5 結果判斷

試驗有效性判斷：陽性對照孔OD值平均值≥1.00且陰性對照孔OD值平均值≤0.15。臨界值計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。陰性判斷：樣品OD值<臨界值，則樣品為陰性。陽性判斷：樣品OD值>臨界值，則樣品為陽性。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析

采用SPSS21.0軟件對不同采樣地區(qū)牦牛支原體血清抗體陽性率進行顯著性分析，P>0.05時，差異不顯著性；P<0.05時差異顯著；P<0.01時，差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 青藏高原牦牛支原體檢測結果

由表1可得，四省(區(qū))牦牛支原體抗體平均陽性率為48.70 %(467/959)：其中四川、甘肅、西藏、青海陽性率分別為64.29 %(36/56)、53.09 %(129/243)、46.10 %(201/436)、45.09 %(101/224)。

對不同省區(qū)牦牛支原體抗體檢測結果進行差異分析，結果顯示，四川地區(qū)牦牛支原體抗體陽性率與甘肅地區(qū)比較，差異不顯著(P>0.05)，與青海和西藏比較，差異均顯著(P<0.05)；甘肅、西藏、青海3地比較，牛支原體抗體陽性率差異均不顯著(P>0.05)。

2.2 不同年齡牦牛血清抗體陽性率檢測結果

由表2可知，四省區(qū)不同年齡牦牛支原體抗體陽性率分布如下：四川1歲以下為77.78 %；1～2歲為63.64 %；3～6歲為58.82 %；6歲以上為63.16 %；甘肅1歲以下為60.00 %；1～2歲為48.94 %；3～6歲為43.66 %；6歲以上為60.00 %；西藏1歲以下為52.78 %；1～2歲為44.58 %；3～6歲為43.41 %；6歲以上為46.05 %；青海1歲以下為51.35 %；1～2歲為41.86 %；3～6歲為46.97 %；6歲以上為42.31 %。4省區(qū)不同年齡牦牛支原體抗體平均陽性率分布如下：1歲以下為55.70 %；1～2歲為46.20 %；3～6歲為45.20 %；6歲以上為49.70 %。

對不同年齡牦牛支原體抗體檢測結果進行差異分析表明，從不同省區(qū)來看，不同年齡段牦牛支原體抗體陽性率比較，差異均不顯著(P>0.05)；從總體平均陽性率來看，1歲以下牦牛支原體抗體陽性率高于3～6歲，且差異顯著(P<0.05)，其余差異不顯著(P>0.05)。

表1 藏區(qū)各地牦牛支原體抗體陽性率檢測結果及顯著性分析

注：同列數(shù)據(jù)進行比較，含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不含有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

2.3 不同性別牦牛血清抗體陽性率檢測結果

由表3可知，四川省牦牛支原體抗體陽性率雄性和雌性分別為52.63 %、70.27 %；甘肅省雄性陽性率為40.45 %，雌性陽性率為60.39 %；西藏雄性陽性率為50.41 %，雌性陽性率為44.44 %；青海省雄性陽性率為43.30 %，雌性為46.46 %。四省區(qū)總體陽性率來看，雄性陽性率為45.71 %，雌性陽性率為50.24 %。

對不同性別牦牛支原體抗體檢測結果進行差異分析表明，甘肅省雌性陽性率高于雄性，且差異顯著(P<0.05)；四川、西藏、青海不同性別比較，其陽性率差異不顯著(P>0.05)。從總體結果來看，四個省區(qū)雌性平均陽性率高于雄性，但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

根據(jù)D. L. Grand 等的研究：應用血清學方法檢測牛支原體血清抗體陽性率，并能夠以此為依據(jù)評價牛支原體的感染[6]。我國青藏高原牦牛均未接種牛支原體疫苗，因此本次檢測結果能夠反應牦牛支原體感染狀況。

表2 不同年齡牦牛血清抗體陽性率檢測結果及顯著性分析

注：同行數(shù)據(jù)進行比較，含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不含有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

表3 不同性別牦牛血清抗體陽性率檢測結果及顯著性分析

注：同行數(shù)據(jù)進行比較，含有相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不含有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Compared with the data in the same column, if there are the same letters, the difference is not significant (P> 0.05), otherwise the difference is significant.

本次試驗采用ELISA檢測方法，對四川、甘肅、青海3省區(qū)牦牛支原體血清抗體進行檢測，并按照不同年齡、不同性別進行統(tǒng)計分析，用卡方檢驗對牦牛支原體血清抗體陽性率進行顯著性分析。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，四川、甘肅、西藏[5]、青海陽性率依次為64.29 %、53.09 %、46.10 %、45.09 %。四川陽性率與青海和西藏比較，差異均顯著(P<0.05)，與甘肅地區(qū)比較，差異不顯著(P>0.05)；甘肅、西藏、青海3地比較，陽性率差異均不顯著(P>0.05)。由此可見，我國青藏高原牦牛感染牛支原體較為普遍，且以四川省較為嚴重，其次是甘肅省。

2012年，李坤[7]等人的研究結果表明，四川牦牛支原體血清抗體陽性率為47.41 %，2013年，其陽性率為55.25 %[8]。與本次檢測結果(64.29 %)比較可知，2012年以來，四川牦牛支原體血清抗體陽性率呈現(xiàn)較快增長趨勢。根據(jù)李坤[7-8]等人的研究，2012、2013年西藏牦牛支原體血清抗體陽性率依次為44.32 %、44.50 %；2017年，本人對來自西藏全區(qū)的 436 份牦牛血清進行檢測，結果檢出陽性血清201份，其陽性率為46.10 %[5]。由此看出，2012年以來，西藏地區(qū)牦牛對牛支原體存在持續(xù)感染狀態(tài)，并且呈現(xiàn)緩慢上升趨勢。2011年，魏廷虎[9]的檢測結果表明青海省玉樹縣牦牛支原體血清抗體陽性率為25.39 %；本次檢測結果表明，青海省陽性率為45.09 %，由此證明，2011年以來青海省牦牛支原體血清抗體陽性率呈現(xiàn)較快上升趨勢。

從不同年齡段牦牛血清抗體陽性率檢測結果來看，不同省區(qū)不同年齡段牦牛支原體抗體陽性率比較，差異均不顯著(P>0.05)，但1歲以下牦牛抗體陽性率均高于其他年齡段；從總體平均陽性率來看，1歲以下牦牛支原體抗體陽性率高于3～6歲，且差異顯著(P<0.05)。其原因可能是因為犢牛的抵抗力較弱，應激反應較成年牛強烈，且該病存在垂直傳播。此外，青藏高原地區(qū)犢牛感染率較高還與青藏高原高寒缺氧、晝夜溫差大、多風雪天氣等特殊的氣候環(huán)境有關；與傳統(tǒng)的散養(yǎng)、放養(yǎng)為主的飼養(yǎng)模式，飼養(yǎng)管理條件差等有關。因此，犢牛支原體肺炎的預防應考慮以下幾點：首先要特別注意犢牛的飼養(yǎng)管理，避免溫度驟變，寒冷和過度擁擠，提高犢牛免疫力；其次，應做好牛群中牛支原體病的監(jiān)測，及時淘汰病牛，避免牛支原體陽性母牛產(chǎn)犢，切斷垂直傳播途徑；最后，應盡量避免牛只特別是犢牛的遠距離運輸，減少應激反應造成的牛支原體感染。

從不同性別牦牛血清抗體陽性率檢測結果來看，甘肅省雌性陽性率高于雄性，且差異顯著(P<0.05)；四川、西藏、青海不同性別比較，其陽性率差異不顯著(P>0.05)。從總體結果來看，雌性總體平均陽性率高于雄性，但差異不顯著(P>0.05)。謝建華[10]等人的研究結果表明，奶牛的易感性高于肉牛。其原因可能與雌性在妊娠、分娩過程中自身抵抗力較低，且容易患乳腺炎等因素有關。

自1962年Hale[11]等人首次從乳房炎病牛乳中分離到牛支原體以來，牛支原體相關疾病在多個國家相繼出現(xiàn)并被報道，其中以歐洲最為嚴重。據(jù)資料顯示，在歐洲有1/4～1/3的犢牛肺炎是牛支原體引起；在美國，單個牛場牛支原體感染率可高達70 %，由此引發(fā)的奶牛乳腺炎和牛呼吸道疾病給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[12]。目前，牛支原體已經(jīng)呈世界性分布，在越來越多的國家、地區(qū)流行和報道，在全球的分布亦呈現(xiàn)持續(xù)感染和逐年上升趨勢。

4 結 論

本次試驗結果表明，我國四川、甘肅、西藏、青海在內(nèi)的牦牛主產(chǎn)區(qū)內(nèi)，牦牛感染牛支原體較普遍，以四川和甘肅最為嚴重，且四川、西藏和青海呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。1歲以下牦牛易感性最強；雌性比雄性易感性強。因此，我國青藏高原牦牛群存在較大的牛支原體感染風險，應特別注意犢牛和母牛的飼養(yǎng)管理，采取綜合性防治措施，預防和控制該病的發(fā)生和蔓延。由于項目資金等問題，本次流行病學研究未包含我國新疆和云南兩地，有待后續(xù)進一步調(diào)查研究和完善。