多藥物耐藥基因多態性與缺血性腦卒中患者阿司匹林抵抗的相關性分析

郭 升

(羅田縣人民醫院，湖北 羅田 438600)

在對心腦血管疾病進行一級、二級預防比較常見且效果顯著的藥物就包含阿司匹林，曾有研究指出，患者規律性服用阿司匹林可有效降低心腦血管事件的發生[1]。但是盡管患者長期規律性服用阿司匹林，但仍有許多患者會發生心腦血管疾病，也就是說阿司匹林治療效果失敗[2]。服用阿司匹林的患者發生血栓大多數是因為血小板聚集不能被抑制，進而發生心腦血管疾病，筆者稱其為阿司匹林抵抗(AR)[3]。基因變異、藥物相互作用以及生物利用度低等多種因素均會導致阿司匹林抵抗[4]。目前對于阿司匹林抵抗患者基因因素的研究已成為臨床研究熱點[5]。P-糖蛋白是有多藥物耐藥基因編碼，是一種ATP依賴性藥物轉運膜蛋白，在多種藥物的藥代動力學中起著非常重要的作用[6]。該蛋白可在腸道上皮細胞表面進行表達，有腸上皮細胞將其底物逆向轉運至腸腔，使藥物吸收受到限制，降低藥物的生物利用度[7]。而P-糖蛋白的其中一項作用底物即為阿司匹林。筆者對多藥物耐藥基因與阿司匹林抵抗之間的相關性進行分析，進而進一步了解阿司匹林抵抗的發生原因。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2016年5月～2017年5月我院收治缺血性腦卒中患者230例，根據其對阿司匹林的敏感程度，將阿司匹林敏感(AS)80例設為對照組，阿司匹林抵抗(AR)150例設為研究組。本研究獲得醫院倫理委員會批準。納入標準：①經CT檢查，入組患者確診為缺血性腦卒中；②患者在發病后均口服阿司匹林進行規律治療；③入組患者對于本次研究內容知情，并且在同意書上簽字。排除標準：①患者同時服用其他抗血小板藥物、抗凝藥物或非甾體類藥物治療；②患者對本次研究所用藥物過敏；③患者伴有哮喘；④患者伴有嚴重肝腎功能障礙；⑤患者存在嚴重的精神障礙或溝通障礙。

1.2方法

1.2.1進行樣本收集：取患者清晨空腹上肢靜脈血，置于EDTA管中，在-20℃的低溫冰箱中儲存備用，提取基因組DNA，將其放置于-20℃的低溫冰箱中儲存備用。

1.2.2進行聚合酶鏈式反應試驗：本次研究采用直接測序法以及聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性技術分析，聚合酶鏈反應體系為2 m模板DNA、2+TaqMasterMixl2.5td 、5 μl上下游引物、0.5 μl超純凈水補足體系至25 μl，將其充分混勻。聚合酶鏈式反應的擴增條件，3 min預變性94℃，30 s變性94℃，30 s延伸72℃，5 min最后延伸72℃，用2%瓊脂糖凝膠對擴增產物進行電泳，染色使用Gelred進行，觀察結果在紫外燈下進行。

1.2.3進行酶切消化:取2 μl聚合酶鏈式反應產物，1 μl內切酶，2 μl 10×NEB Burrer，5 μl滅菌離子雙蒸餾水，總反應體積為10 μl，酶切反應在37℃下進行，時間為30 min。電泳使用2%瓊脂糖凝膠以及140 V穩定電壓進行，時間為30 min，染色使用Gelred進行，觀察結果在紫外燈下進行。

1.2.4對基因進行測序:由生工生物工程股份有限公司進行聚合酶鏈式反應引物以及樣本測序。

1.3觀察指標:觀察患者相關臨床指標，包括年齡、性別、空腹血糖水平、總膽固醇水平、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、吸煙史、高血壓疾病以及飲酒史等。

2 結果

2.1兩組臨床資料比較:研究組吸煙患者概率、空腹血糖水平以及總膽固醇水平高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，研究組性別、年齡、高血壓病史、飲酒史、三酰甘油水平、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 臨床資料對比

項目研究組(n=80)對照組(n=120)檢驗值P值性別[例(%)] 男46(57.5)80(66.7)1.314>0.05 女34(42.5)40(33.3)年齡(x±s,歲)63.1±11.563.1±11.41.344>0.05空腹血糖(x±s,mmol/L)6.5±1.55.7±1.114.397<0.05總膽固醇(x±s,mmol/L)5.4±1.24.4±1.114.971<0.05三酰甘油(x±s,mmol/L)1.5±0.41.6±0.61.314>0.05低密度脂蛋白(x±s,mmol/L)2.5±0.62.3±0.40.464>0.05高密度脂蛋白(x±s,mmol/L)1.2±0.31.3±0.21.034>0.05吸煙史[例(%)] 是27(33.8)24(20.0)14.613<0.05 否53(66.3)96(80.0)高血壓病史[例(%)] 是38(47.5)69(57.5)1.464>0.05 否42(52.5)51(42.5)飲酒史[例(%)] 是8(10.0)6(5.0)0.311>0.05 否72(90.0)114(95.0)

2.2基因頻率及基因型分析：本次研究納入患者，研究組等位基因檢測數量為158，對照組組等位基因檢測數量為446，其中研究組C3435T位點的T等位基因頻率及CT+rI-11基因型高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3阿司匹林抵抗危險因素Logistic回歸分析：阿司匹林抵抗獨立危險因素包含吸煙史、基因型、空腹血糖、總膽固醇，差異具有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 基因頻率及基因型對比[例(%)]

項目研究組(n=80)對照組(n=120)χ2值P值等位基因C1236TC136(86.1)396(88.8)0.464>0.05T22(13.9)50(11.2)G2677T/AA22(13.9)67(15.0)0.391>0.05G58(36.7)187(41.9)T78(49.4)192(43.0)C3435TC66(41.8)254(57.0)4.641<0.05T92(58.2)192(43.0)基因型C1236TCC58(72.5)94(78.3)0.487>0.05CT22(27.5)26(21.7)G2677T/AAA1(1.3)2(1.7)0.367>0.05AT13(16.3)19(13.3)AG8(10.0)12(10.0)GG10(12.5)21(17.5)GT32(40.0)47(39.2)TT16(20.0)19(15.8)C3435TCC17(21.3)41(34.2)4.391<0.05CT34(42.5)54(45.0)TT29(36.3)25(20.8)

表3 阿司匹林抵抗危險因素Logistic回歸分析

因素β值標準誤χ2值P值OR值95%CI吸煙史0.7520.3044.347<0.052.1341.131～3.897基因型1.5120.5475.317<0.054.2341.314～12.141空腹血糖0.1360.0935.347<0.051.6740.947～1.453總膽固醇0.7210.2816.177<0.052.1371.171～3.547

3 討論

近年來，關于多藥物耐藥基因編碼產物P-糖蛋白對于疾病以及藥物的影響研究已成為熱點，P-糖蛋白作為外排泵，可以對有機陽離子、多糖、蛋白質以及氨基酸產生對抗作用，進而起到保護的目的[8]。但是，該蛋白可以將藥物利用ATP水解釋放的能量泵出細胞，降低細胞內的藥物濃度，進而導致機體表現出耐藥性。曾有學者在研究中指出，細胞內阿司匹林的濃度會通過P-糖蛋白膜蛋白轉運功能進行調節，當P-糖蛋白表達水平明顯增加時，阿司匹林在細胞內的濃度會降低，進而使阿司匹林對小腸的損傷程度降低[9]。因此可以看出，多藥耐藥基因多態性可能會對P-糖蛋白的表達以及活性產生影響，進而使機體對于阿司匹林的分布、吸收受到影響，使有效血藥濃度降低，進而形成阿司匹林抵抗情況[10]。

筆者此次研究通過對缺血性腦卒中患者進行分析，研究發現，研究組吸煙患者概率、空腹血糖水平以及總膽固醇水平高于，差異有統計學意義(P<0.05)，研究組性別、年齡、高血壓病史、飲酒史、三酰甘油水平、高密度脂蛋白以及低密度脂蛋白水平與對照組無明顯差異(P>0.05)，且研究組C3435T位點的T等位基因頻率及CT+rI-11基因型高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。筆者此次研究中發現基因型C3435T與阿司匹林抵抗有關，因此，筆者認為T地位基因有可能是導致患者出現阿司匹林抵抗的一個危險因素。而且在研究中得出，吸煙、空腹血糖以及總膽固醇也會增加患者發生阿司匹林抵抗的發生，因此建議對阿司匹林抵抗患者進行綜合分析。

綜上所述，C3435T基因多態性與阿司匹林抵抗有關，吸煙史、基因型、空腹血糖以及總膽固醇含量是阿司匹林抵抗的獨立危險因素。