17β-雌二醇對腎缺血再灌注損傷后腎間質纖維化的影響

丁 寧，周奧飛，章林明，李 麗，王勤章，李應龍

(石河子大學第一附屬醫院，新疆 石河子 832000)

缺血再灌注(ischemia reperfusion，I/R)損傷屬于較為常見的臨床損傷，而作為高灌注器官的腎臟，特別容易在I/R過程中受到損害。缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,IRI)是指機體通過灌注血液后，原本缺血的狀態雖然得以改變，但是缺血組織并未恢復正常的代謝功能，反而因為缺血灌注而導致損傷加劇，出現水腫、充血、纖維化等病理改變[1]。此種損傷常出現于休克后復蘇、腎部分切除術、腎積水、腎移植手術、腎臟動脈血管成形術、選擇性尿路手術、腎腫瘤切除術等[2]。腎臟在缺血再灌注損傷過程中，腎小管上皮細胞是損傷最為嚴重的部位。近年來，許多文章表明，腎IRI晚期可發生腎臟纖維化[3-4]。目前常見的急慢性腎臟疾病晚期大都伴隨著纖維化病變。IRI對腎臟遠期損害顯著，主要是對其功能的影響。如在腎移植術后，移植腎失去功能、腎臟纖維化以及急性或慢性排斥反應。所以改善IRI對腎移植后移植物遠期影響的重要方式之一就是延緩或者減輕纖維化這一過程，在其他臟器移植手術后，減輕纖維化亦可增加移植物的存活率[5]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)在腎纖維化進程中起到重要作用，在纖維化形成、細胞增殖、凋亡、肥大過程中都有發揮作用[6]。TGF-β是一種分布十分廣泛、可在機體內幾乎所有細胞生成的一種具備多向調節能力的生長因子，并且有多達5種同分異構體，其中在人體中所占比例最高且活性最強的是TGF-β1[7]。腎間質纖維化的主要病理改變是正常組織被腎細胞外基質(extra cellular matrix，ECM)所取代[8]，TGF-β1的過度表達可促進這一過程的發展。有實驗證明，其通過增加腎小球系膜細胞和成纖維細胞等細胞外基質合成增多，從而促進纖維化的進展[9]。實驗證明TGF-β1的過度表達可促進腎小球系膜細胞和近曲小管上皮細胞等細胞ECM的合成，進而促進腎纖維化[10]。在腎臟進行性纖維化過程中，TGF-β1是造成纖維化的關鍵中間產物，同時TGF-β1的表達水平可間接反映腎臟的纖維化[11]。

雌激素是一種生物效能非常廣泛的類固醇激素，MARIC等提出其抗纖維化作用機制主要在于其參與膠原、系膜基質的合成與降解[12]。但是在腎小管上皮細胞間質病變過程中，對于此類固醇激素抑制纖維化的機制尚不明確。17-β雌二醇(E2)是雌激素的主要活性成分。本研究通過大鼠動物手術造模模擬體內缺血/再灌注模型，并通過雌激素干預，檢測干預組與對照組之間的病理變化、纖維化水平和TGF-β1表達變化，以此探究雌激素對腎缺血再灌注損傷后纖維化過程中所發揮的作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物：選取32只雌性SD大鼠，體重250～300 g，周齡8～12周，分為4組，每組8只。動物房室內溫度及濕度合適，提供標準飼料，進食水未干預，室內環境適合，正常飼養1周后進行實驗。

1.2主要試劑與儀器：17β-雌二醇；Masson實驗試劑；兔源多克隆TGF-β1抗體(Abcam公司)；β-actin 一抗、羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)

1.3方法

1.3.1動物模型制備：實驗研究對象為32只雌性SD大鼠，根據已報道的雌激素干預研究動物模型進行造模[13]。實驗前先對大鼠進行去卵巢處理，具體流程如下：首先麻醉大鼠，準備手術消毒、備皮、鋪巾工作，以腹部正中為切入口，刀口從恥骨聯合上方1 cm到劍突下方，將暴露后的雙側卵巢切除后，縫合傷口。手術后，喂養2周可正式開始研究實驗。每組8只，共4組，分組如下：第一組為正常組(control組)，該組大鼠不采取任何措施；第二組為假手術組(Sham組)，對大鼠腹部注入戊巴比妥鈉50 mg/kg進行麻醉，術區備皮、碘伏擦拭、鋪蓋無菌洞巾，以腹部正中作為切入口，刀口從恥骨聯合上方1 cm到劍突下方，暴露雙側腎臟后，將右側腎臟切除，不做夾閉左側腎蒂，手術持續約45 min后關閉腹腔；第三組為缺血再灌注損傷組(L/R組)，對大鼠進行麻醉并剔除腹部毛發，用碘伏對腹部手術位置進行消毒處理，以腹部正中作為切入口，刀口從恥骨聯合上方1 cm到劍突下方。與假手術組同方式處理右側腎臟，但是左側腎蒂采用無創動脈夾夾閉，觀察大鼠腎臟顏色是否發生變化，當鮮紅色轉變為暗紅色時說明缺血成功，反之則表明手術失敗。45 min后，去除左側腎蒂的無創動脈夾，恢復腎臟灌流；第四組為17β-雌二醇預處理干預組(E2+I/R組)，術前3 d連續給予17β-雌二醇100 μg/(kg·d)皮下注射，第4天進行手術，其余處理同I/R組。為模擬I/R組和E2+I/R組雌激素注射，用等量的生理鹽水分別注入Control 組和 Sham 組大鼠腹腔內。所有大鼠繼續飼養2周后，斷頸處死后解剖剝離腎臟。

1.3.2蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色：剝離后的大鼠腎臟沿縱向切開，等量分成兩部分，一部分儲存于-80℃，另一部分浸泡在福爾馬林中固定24 h后，使用石蠟包埋處理，切片，HE染色液進行染色，通過顯微鏡觀察切片中組織病理形態的變化。將腎小管間質組織損傷程度用Paller法表示出來：使用光學顯微鏡，在200倍視野下，隨機觀察10個腎小管，對其進行評估，具體評分依據：腎小管管徑增加、細胞形態改變計1分；刷狀緣改變計1分，脫落計2分；管型計2分，腎小管管腔內有脫落壞死的細胞計1分。

1.3.3Masson染色：組織固定液處理后腎組織乙醇脫水，石蠟包埋，切片，將切片經馬松染色處理，光鏡下觀察各組腎組織纖維化改變情況。

1.3.4Western blot 法檢測腎組織TGF-β1蛋白表達水平：將腎臟組織放入液氮中研磨，并用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA對研磨后的組織進行裂解，將組織總蛋白分離出來，采用BCA法進行蛋白定量并加入4xLoading Buffer，95℃加熱10 min進行預變性，對所取樣的蛋白進行電泳、轉膜操作，再用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，經過TGF-β1及β-actin一抗孵育過夜(濃度為1∶1 000)，TBST洗三遍，室溫孵育HRP連接二抗1 h(濃度1∶3 000)，使用化學發光法進行曝光、拍照，應用ImageJ分析條帶灰度值。

1.4統計學處理：通過SPSS22.0軟件來處理相關數據信息，用繪圖來代表，運用One-way ANOVA進行統計，Turkey多重檢驗分析組間差異，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1腎組織病理學檢查及組織Paller評分：基于Paller法評分，Control組、Sham組：腎組織形態結構無明顯變化；I/R組腎小球結構明顯變化，出現萎縮，腎小管出現腫脹、壞死及細胞脫落，管腔大小明顯改變、腎間質均出現了病理變化，Paller評分較Sham組明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；E2+I/R組腎小球結構無明顯改變，腎小管上皮細胞、腎間質、炎性細胞浸潤較I/R組輕，Paller評分較I/R組低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。圖A-c黑色箭頭為較典型的腎小管病理變化。

2.2Masson染色后各組腎組織纖維化改變情況：細胞外膠原纖維呈藍色，胞漿呈紅色，胞核呈黑藍色。觀察可見Control組、Sham組大鼠腎小管上皮細胞均勻排布，腎小囊、小管基底膜腎小球系膜與血管周圍藍染區均較少；I/R組腎小管間質出現大量膠原堆積；E2+I/R組雖然有少量藍色膠原堆積，但較I/R組少。見圖2。

2.3Western blot 法檢測TGF-β1蛋白表達：通過imageJ將TGF-β1與β-actin條帶灰度值進行相對定量統計，I/R 組TGF-β1較Sham組要表達水平高;E2+I/R組的蛋白表達要比I/R組少，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

a. control組；b.sham組；c.I/R組；d.E2+I/R組

a.control組；b.sham組；c.I/R組；d.E2+I/R組

圖3 各組大鼠腎組織TGF-β1蛋白表達量變化

3 討論

腎臟作為機體血液高灌注器官之一，在很多疾病或術式中易受到缺血再灌注損傷，如腎移植、腎部分切除等。腎缺血再灌注損傷發生后，主要涉及腎小球和腎小管功能的損傷，近年許多研究已證明，缺血再灌注損傷后期可出現腎小管間質纖維化[15]。腎臟疾病如果不及早進行控制，發展到最后就會演變成腎間質纖維化，最終會造成腎衰竭。之所以會出現腎臟纖維化，是因為沒有對慢性腎病重視起來并未控制其發展。在各種疾病不斷發展后期常見病理變化為細胞外基質堆積(ECM)，健康細胞由新生的ECM充當，造成一系列難以逆轉的腎臟疾病[16]。本課題以大鼠夾閉腎蒂45 min后恢復灌注來模擬缺血-再灌注損傷，可以反映出腎移植期間的缺血情況。根據HE及Masson染色結果，I/R組大鼠腎小管上皮細胞出現腫大、壞死、萎縮；間質也出現了纖維化，說明造模成功。

研究證實，TGF-β1信號轉導通路是影響腎間質纖維化的主因素之一[17]。臨床研究表明，腎小球出現硬化、間質纖維化與TGF-β1信號通路的激活密切相關[18]。TGF-β1一方面對系膜細胞、上皮細胞、成纖維細胞起調節作用，從而產生大量ECM堆積；另一方面它增加蛋白酶抑制因子的合成，使ECM無法降解。TGF-β1的過度表達就會造成腎小球與小管間質系列問題，最終使其向纖維化等方向演變。TGF-β1可參與許多與腎間質纖維化有關的反應，涵蓋加速基質的合成、抑制基質的降解、上調整合素基質黏附分子的表達從而趨化成纖維細胞和單核細胞到達損傷部位。腎臟瘢痕出現期間，因TGF-β1導致細胞外基質越來越多，組織受到的侵害也越來越嚴重。研究顯示，對TGF-β1的生物活性進行控制，可以有效減少細胞外基質成分，對纖維化的控制也有顯著效果[19-20]。

之前的研究已經證實，人體纖維化疾病的發展因性別而有區別：女性比男性更抗纖維化[21]；與男性及絕經后婦女相比，絕經前婦女患嚴重肝纖維化的風險較低[22]。越來越多的證據表明，雌激素能抑制多個器官的細胞和纖維化的激活，包括肝臟、心肺和腎臟[23-24]。雌激素是一種具有廣泛生物活性的類固醇激素，臨床顯示，雌激素對腎素-血管緊張素系統以及腎內、外血流動力學有一定的作用，從而調節腎小球功能，減輕灌注壓力；對VEGF的表達有促進作用，增加系膜細胞的活性，使細胞外基質合成表達能力降低，同時對抗氧化劑與脂代謝等，具有調節功能，減輕腎功能受害程度[25]。雌激素可以緩解腎組織的損傷程度，使ECM成分盡可能控制在一定范圍內，對腎間質纖維化起到控制作用；作用于TGF-β1可以改變其活性從而使其表達受限，可以一定程度上抑制上皮細胞向肌成纖維細胞轉變，有效抑制ECM的合成，從而使病變腎組織ECM合成減少，降解增加，從而延緩腎間質纖維化的發展。

本次研究表明，雌激素會緩解缺血再灌注損傷大鼠腎間質纖維化，且減少TGF-β1的表達水平，由此推測雌激素可通過下調TGF-β1的表達來降低纖維化，但其詳細的機制還需要更深一步研究。

隨著泌尿外科術式不斷進步與發展，傳統根治性腎切除被保留腎單位手術所取代，隨著腎移植手術的不斷進步，腎缺血再灌注損傷所帶來的問題就愈發明顯。終末期腎病較常采用的治療方法之一就是腎移植，但是移植過程中易出現缺血再灌注損傷。如何降低腎缺血再灌注損傷導致的移植物遠期功能異常也成為腎移植領域研究熱點之一。本試驗為腎臟缺血再灌注損傷的防治提供依據，也為其他纖維化腎臟疾病的臨床治療提供新思路。