MLST和PFGE在耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌醫院感染監測中的應用

賀文芳，周 柯，周 磊，劉家云，馬越云，閆 沛，徐修禮，郝曉柯

(空軍軍醫大學西京醫院 1. 檢驗科 全軍臨床檢驗醫學研究所； 2. 護理部；陜西 西安 710032)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)屬于人體正常菌群，也是條件致病菌，其引起的社區獲得性和醫院獲得性感染逐年增加，特別是高毒力肺炎克雷伯菌和多重耐藥肺炎克雷伯菌的傳播，給臨床治療帶來極大的困難[1]。臨床重癥感染患者的不斷增加，碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，使得耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)菌株檢出呈逐年增多的趨勢。CRKP具有在醫院廣泛傳播的潛在風險，其引發的臨床感染病死率較高，治療藥物有限，給患者、醫院和社會帶來極大的影響和危害[2]。多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)和脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)是兩種最常用于細菌分型的分子生物學方法，可用于分析醫院分離CRKP的基因型和同源性，從切斷感染途徑方面入手指導、控制多重耐藥菌的傳播。本研究收集某醫院重癥監護病房(ICU)4個月內連續檢出的10株CRKP，進行抗菌藥物敏感性試驗和碳青霉烯酶基因檢測，并應用MLST和PFGE方法進行菌株同源性分析，發現其傳播規律和流行特點，為醫院感染暴發的有效預防提供防控依據。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集2017年9—12月某三甲醫院ICU連續檢出的CRKP。

1.2 主要儀器試劑 VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統、GN革蘭陰性菌鑒定卡片、AST-GN13革蘭陰性菌藥敏卡片(法國Biomerieux)，GeneXpert分子診斷系統、XpertCarba-R碳青霉烯酶基因檢測試劑盒(美國Cepheid)，抗菌藥物藥敏紙片(英國Oxoid)，血瓊脂培養基、M-H培養基(鄭州安圖生物)，質控菌株大腸埃希菌ATCC 25922，肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和ATCC BAA1706(國家微生物菌種保藏中心)。聚合酶鏈式反應(PCR)擴增儀、凝膠電泳成像系統、CHEF MapperXa脈沖場凝膠電泳系統(美國Bio-Rad)，限制性內切酶XbaI(中國TaKaRa)，Gel Red核酸染料(美國Biotium)。

1.3 抗菌藥物敏感性試驗 采用VITEK 2 Compact系統和配套的細菌鑒定卡片、藥敏卡片進行鑒定以及相應的藥敏試驗，檢測抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)，采用K-B法補充檢測部分藥物敏感試驗。藥敏結果依據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)藥敏試驗2019年 M100-29th標準判斷結果。

1.4 碳青霉烯酶檢測 根據CLSI M100-29th腸桿菌科細菌碳青霉烯酶檢測方法進行mCIM試驗和eCIM試驗，采用賽沛XpertCarba-R試劑盒檢測blaKPC、blaNDM、blaVIM、blaOXA-48和blaIMP 5個碳青霉烯酶基因。

1.5 多位點序列分型(MLST) 采用煮沸法提取細菌DNA，PCR擴增rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB 7個管家基因，引物參考Pasteur數據庫。PCR條件：94℃ 2 min，94℃ 30 s、50℃ 1 min、72℃ 30 s共35個循環，72℃ 5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定為單一條帶后，送上海生工生物公司測序。將管家基因的序列在Pasteur數據庫(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb. pl?db =pubmlst_klebsiella_seqdef_public&page =sequenceQuery)進行比對，獲得管家基因型別，將7個管家基因型別組合獲得菌株ST型別。

1.6 脈沖場凝膠電泳(PFGE)分析 參考美國疾病控制與預防中心(CDC)PulseNet提供的PFGE相關標準化操作程序，調整相關電泳條件，試驗方法如下：用比濁儀調整細菌懸液濃度，達4.2～4.5麥氏濁度單位；加入1% Seakem Gold：1% SDS膠，混勻制備膠塊；用含蛋白酶K的細胞裂解液CLB在54℃水浴搖床中強力震蕩(170～180 r/min)消化2 h；用無菌純水洗滌膠塊2次，TE緩沖液洗滌膠塊3次；加入20U XbaⅠ限制性內切酶按比例配制酶切反應體系，37℃水浴孵育6～8 h后，電泳儀中進行脈沖場電泳；電泳參數為電場強度6 V/cm，夾角120度，初始脈沖為6 s，最終脈沖為36 s，電泳時間19 h；電泳結束后，使用Gel Red核酸染料染色，在美國Bio-Rad凝膠成像系統中成像保存圖片。

1.7 數據處理 應用BioNumerics軟件進行數據分析，選擇Diec相關系數和UPGMA方法。

2 結果

2.1 一般資料 共收集ICU CRKP菌株10株，分別標為1、2、3…10號菌株，其中1～8、10號菌株分離自5例(分別標為A、B、C、D、E)患者的臨床感染標本，9號菌株分離自病房氣壓治療儀面板。5例患者均為男性，年齡28～55歲，平均(46.2±11.3)歲；患者A、C、D痰標本，患者B血、引流液標本，以及患者E血、分泌物標本中各分離1株CRKP菌株，患者E痰標本中先后分離2株CRKP。同期ICU醫生、護士的手，治療車、監護儀、微量泵、血氣分析儀、床欄、床頭柜、門把手，以及護士長使用的電腦鍵盤等32個部位環境監測標本中均未分離出CRKP菌株。

2.2 藥敏結果 10株CRKP菌株對青霉素類、頭孢菌素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類和碳青霉烯類抗菌藥物均呈高水平耐藥；6～8號及10號CRKP菌株對四環素類抗生素敏感，其余1～5號及9號CRKP菌株對包括替加環素在內的四環素類呈高水平耐藥。1～5號及9號CRKP菌株具有相同的耐藥表型，而6～8號及10號CRKP菌株具有相同的耐藥表型。見表1。

表1 10株CRKP菌株對抗菌藥物的敏感結果

注：R為耐藥；S為敏感。

2.3 碳青霉烯酶檢測結果 10株CRKP菌株mCIM試驗均陽性，eCIM試驗均陰性。經賽沛XpertCarba-R試劑盒檢測，均檢出blaKPC碳青霉烯酶基因。

2.4 MLST結果 CRKP 7個管家基因的PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證結果如圖1所示。PCR測序結果經DNAMAN比對、拼接，得到的序列上傳到Pasteur中KPNMLST數據庫進行比對分析，10株CRKP均為ST 11型。

2.5 PFGE分型結果 10株CRKP菌株經XbaI酶剪切， PFGE后得到5種帶型。其中2～5號及9號CRKP菌株電泳帶型完全一致，結合MLST均為ST 11型，考慮為同一來源，為流行菌株。1號CRKP菌株與流行菌株僅有1條條帶的差異，兩者親緣關系接近?；颊逧標本中分離的6～8號和10號CRKP菌株有三種帶型，與流行菌株條帶相差3條以上，來自痰的6號和與來自血的10號菌株帶型相同，但與同來自于痰的7號菌株帶型不同。見圖2。

M：分子量標準；條帶1～7：依次為rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB、tonB基因。

圖1 CRKP管家基因PCR擴增結果驗證

Figure 1 PCR amplification results of CRKP house-keeping genes

圖2 10株CRKP PFGE及聚類圖

3 討論

2018年CHINET細菌耐藥監測網報道，在呼吸道分離的病原菌中，肺炎克雷伯菌已經超過鮑曼不動桿菌，躍居第一位，其在血等無菌體液的分離率也逐漸升高，僅次于大腸埃希菌，位于第二[3]。CRKP的分離率也居高不下，一項來自中國的多中心研究報道，在所有耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(CRE)分離株中，CRKP占73.9%，耐碳青霉烯類大腸埃希菌(16.6%)和陰溝腸桿菌(7.1%)次之；在所有住院患者中，CRE感染導致的病死率高達33.5%，而CRKP在血流感染和下呼吸道感染致死率則更高[4-5]。CRKP感染主要與肺炎克雷伯菌定植或感染病史、腸外營養，使用第三代頭孢菌素或碳青霉烯類抗生素有關[6]。

CRKP致死率高的原因之一是對抗菌藥物廣泛耐藥，文獻[4, 7]報道CRKP對頭孢菌素類、喹諾酮類耐藥率高達85%以上，對氨基糖苷類的耐藥率較低，但也高達50%以上，而對革蘭陰性菌感染治療最后防線替加環素的敏感率僅有40.2%。本研究10株CRKP菌株中，6株對測試的所有抗菌藥物均耐藥。替加環素K-B紙片擴散法的抑菌圈僅有7 mm，表現為高水平耐藥。CRKP對碳青霉烯類耐藥的重要機制為產KPC酶，與國內研究[8]一致，其對替加環素耐藥機制可能與外排泵表達上調等有關[9-10]。

國內流行的CRKP主要為產KPC酶的ST 11型[11-12]，與本研究結果一致。但是不同醫院CRKP的流行基因型不盡相同[13-14]，研究CRKP的基因型別及同源性有助于監測醫院感染及其發生路徑，能為切斷感染路徑，控制醫院感染提供依據。MLST和PFGE均可以用作細菌分型，且各有優劣。前者分辨率高，重復性好，數據可共享，可進行不同實驗室間比對，但是測序成本高，分析缺少基因組詳細信息或含有大量基因組島插入序列，不能單獨作為暴發溯源的工具；后者結果穩定，重復性好，可發現大片段的插入、缺失、重組等，酶切位點的點突變以及質粒的獲得、丟失，但操作時間長，受人為影響因素大，分析的是條帶而不是序列[15]，通常推薦將二者結合起來進行同源性分析。

本研究中分離10株CRKP菌株的MLST均為ST 11型，未表現出菌株間差異；而通過PFGE分型得到5種帶型，其中11月22—28日分離的4株(2～5號)菌株帶型與12月6日于氣壓治療儀面板分離的CRKP(9號)完全一致。經調查該儀器為科室共用設備，考慮本事件為氣壓治療儀為媒介的接觸傳播導致的醫院感染，該結論也表明在研究醫院感染闡明菌株同源性時PFGE是MLST的有力補充。2號和3號CRKP菌株分別分離自同一重癥胰腺炎患者的腹腔引流液和血標本，其PFGE帶型完全一致，推測CRKP可能通過腹腔感染入血；6～8號和10號CRKP菌株分別分離自另一患者的痰、痰、引流液和血標本，只有6號與10號菌株帶型完全相同，推測CRKP是通過呼吸道感染入血，同樣分離自痰的6號菌株與7號菌株同源性在85%以上，可能為變異株，而分離自分泌物的8號菌株帶型差異大，親緣關系較遠。以上兩組數據均表明 PFGE在明確細菌感染路徑方面的優勢。值得注意的是分離自9月16日的1號菌株與本次醫院感染流行株的克隆僅差異一條條帶，Tenove等[16]認為由于細菌具有變異性，在PFGE圖譜分析中，相似值在0.85以上的菌株可以判定為流行病學相關，由此可見本次流行菌株可能為1號菌株變異而來。

綜上所述，PFGE在明確醫院感染細菌傳播路徑，個體細菌感染路徑以及遺傳變異方面具有重要應用價值。杜小莉等[17]也認為PFGE在甄別暴發菌株、高度相關菌株和不相關菌株時有很好的甄別能力，并且分型結果與菌株分離病區、分離時間具有一致性。針對暴發流行菌株，PFGE能夠將相同MLST型別的菌株聚成一簇。此外，本研究也從科室環境、患者自身等多個角度發現，采取有效消毒隔離措施的重要性，尤其是患者共用設備，更需嚴格消毒管理，通過切斷感染路徑即可有效控制醫院感染的發生。