耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌耐藥基因檢測及同源性

周鵬鵬，陳 娜，朱柯蕙，賈晨冉，張峰波，季 萍

(1. 新疆醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗中心,新疆 烏魯木齊 830054; 2. 新疆軍區保障部疾病預防控制中心，新疆 烏魯木齊 830054)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)是一種非發酵的革蘭陰性桿菌，是醫院感染重要致病菌之一[1]。AB可存在于正常人體皮膚、呼吸道、泌尿道以及自然環境中，常導致菌血癥、肺炎、腦膜炎、腹膜炎、心內膜炎，以及泌尿道和皮膚軟組織感染。近年來抗菌藥物的濫用，侵襲性操作不規范等因素導致AB檢出率及耐藥率逐年增加，甚至造成AB醫院感染流行[2]。耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistantAcinetobacterbaumanniiCRAB)是指對亞胺培南或美羅培南等碳青霉烯類抗生素耐藥的AB[3]，目前認為產碳青霉烯酶是AB對碳青霉烯類抗生素耐藥的主要原因[4]。為了解該院CRAB耐藥基因攜帶情況及其醫院感染的可能途徑，收集該院CRAB，采用聚合酶鏈式反應(PCR)進行耐藥基因檢測，脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)進行同源性分析，以期為臨床合理應用抗菌藥物，制定AB醫院感染防控措施提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集該院2017年10月—2018年10月分離的CRAB，剔除同一患者分離的重復菌株。分離菌株經全自動微生物鑒定及藥敏儀進行鑒定及藥敏試驗，部分藥敏試驗及復核采用紙片擴散法(K-B法)，藥敏結果依據美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2018版判斷。以大腸埃希菌ATCC 25922,銅綠假單胞菌ATCC 27853，產酶大腸埃希菌ATCC 35218,肺炎克雷伯菌ATCC 700603為質控菌株。

1.2 主要試劑及儀器 PCR試劑盒，FTAfor Bacterial DNA(美國Whatman公司)。2×Taq PCR Green Mix、GenGreen 核酸染料、DL2000 DNA Marker、DNA快速純化/回收試劑盒均為北京鼎國昌盛生物技術有限公司產品。PCR反應引物由上海生工生物工程有限公司合成。VITEK-MS、VITEK Compact均為法國生物梅里埃公司產品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產品。還包括超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)、游標卡尺(上海精益儀器廠)、微量移液器(Eppendorf)、細菌比濁儀(法國生物梅里埃公司)、PCR儀(BIO-RAD)、電泳儀(北京六一儀器廠)、UV凝膠成像紫外分析儀(北京君益東方電泳設備有限公司)、紫外透照臺(上海山富科學儀器有限公司)、微波爐(美的集團有限公司)、壓力蒸汽滅菌器(山東新華醫療器械有限公司)、脈沖場凝膠電泳儀(美國Bio—Rad公司)。

1.3 耐藥基因檢測 用FTA卡提取各株細菌的DNA，所用引物見表1，PCR擴增體系為：2×Taq PCR Green Mix 12.5 μL，DNA模板2.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 8 μL，共25 μL。基因擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性60 s，55℃退火45 s，72℃延伸60 s，72℃終止延伸5 min，共30個循環。將擴增后的產物置于電泳儀中進行電泳，條件為60 V，時間1 h，電泳后放入凝膠成像系統觀察并拍照記錄。

1.4 PFGE同源性檢測 將CRAB分離培養后，用比濁儀調成OD值為3.6～4.0的菌懸液，加入1% Seakem Gold SDS膠制備膠塊，再用蛋白酶K進行裂解消化，純水洗滌2次，再用TE洗滌4次，每次15 min左右。使用ApaI內切酶進行酶切，37℃水浴中孵育4 h。在脈沖場凝膠電泳儀中進行PFGE，電泳參數為5～20 s，14℃，120°脈沖角度電泳19 h，電泳結束后進行核酸染色，放入凝膠儀中進行觀察并拍照保存。

表1 耐藥基因PCR引物序列及產物長度

Table 1 PCR primer sequence and product length of drug resistance genes

基因名稱序列(5'-3')長度 (bp)ADCP1 GGTATGGC(T/C)GTGGG(T/C/G)GT(T/C)ATTC445P2 CTAAGA(C/G)TTGGTC(G/A)AA(A/G)GGTOXA-23P1 GATGTGTCATAGTATTCGTCG1 067P2 TCACAACAACTAAAAGCACTGOXA-51P1 ATGAACATTAAAGCACTCTTACTT825P2 CTATAAAATACCTAATTGTTCTAAKPCP1 ATGTCACTGTATCGCCGTCTA822P2 TTACTGCCCGTTGACGCCCAACTX-M-9P1 GCGCATGGTGACAAAGAGAGTGCAA877P2 GTTACAGCCCTTCGGCGATGATTCintl1P1 CCGAGGATGCGAACCACTTC373P2 CCGCCACTGCGCCGTTACCAqacE△l-sullP1 TAGCGAGGGCTTTACTAAGC300P2 ATTCAGAATGCCGAACACCGtnpuP1 CCAACTGATGGCGGTGCCTT403 P2 CGGTATGGTGGCTTTCGCant(3″)-IP1 TGATTTGCTGGTTACGGTGAC284P2 CGCTATGTTCTCTTGCTTTTGaac(3)-IP1 AACTACTCCCAACATCAGCC303P2 GTTGAACGCTCGCTAGGCTTEMP1 TGCTTAATCAGTGAGGCACC972 P2 TCGGGGAATGTGGGtraAP1 AAGTGTTCAGGGTGCTTCTGCGC272P2 AAATGGTCATCATGTACATGAC

1.5 數據分析 將凝膠成像儀保存的圖像導入BioNumerily軟件進行處理分析，以Dice系數計算出各菌株之間的相似性系數[5]。SD=2nxy/(nx+ny)，其中nx代表菌株X的總條帶數，ny代表菌株y的總條帶數，nxy為菌株xy共有的條帶數，SD反映的是菌株相似度，范圍在0～1之間，0代表完全不一樣，1代表完全相同，相似性系數80%為分型界值，相似度≥80%為同一亞型，相似度<80%為不同基因型。

2 結果

2.1 一般資料 共收集40株CRAB，分離自40例患者的標本。標本來源分別為血管導管尖端(9株)、引流液(5株)、血(5株)、支氣管灌洗液(5株)、尿(4株)、分泌物(4株)、痰(4株)、腦脊液(2株)、腹腔積液(1株)、膽汁(1株)，28株CRAB來自于重癥監護病房(ICU)。40例患者中男性29例(72.5%)，女性11例(27.5%)；年齡12 d～76歲，>50歲者21例(52.5%)。

2.2 抗菌藥物敏感情況 CRAB對替加環素耐藥率最低(為2.9%)，對阿米卡星、哌拉西林耐藥率分別為37.0%、42.9%。對其他大多數抗菌藥物的耐藥率均>70%。該院同期AB對替加環素、阿米卡星、妥布霉素、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為1.9%、23.3%、37.3%、23.0%,對其他抗菌藥物的耐藥率均>50%。見表2。

表2 CRAB及AB對常用抗菌藥物的耐藥情況

Table 2 Resistance of CRAB and AB to commonly used antimicrobial agents

抗菌藥物CRAB檢測株數R(%)S(%)AB檢測株數R(%)S(%)哌拉西林7 42.957.1 9174.725.3氨芐西林/舒巴坦31 71.012.959357.533.9哌拉西林/他唑巴坦32 81.3 3.155462.132.7頭孢曲松40 80.0 0.096966.410.3頭孢吡肟40 87.510.098067.931.0頭孢哌酮/舒巴坦12 75.0 8.358223.043.3亞胺培南36100.0 0.097963.835.5美羅培南36100.0 0.081967.032.6阿米卡星27 37.063.055023.374.7慶大霉素40 95.0 5.097162.736.0妥布霉素36 55.641.797737.359.8替加環素352.925.7793 1.962.0左氧氟沙星36 91.7 5.697953.835.6環丙沙星36 97.2 0.098067.032.1

注：R表示耐藥；S表示敏感；表中未列出中介結果。

2.3 主要耐藥基因檢測結果 40株CRAB均檢出ADC基因，其他耐藥基因檢出率較高的依次為OXA-51(90.0%)、qacE△1-sull(80.0%)、OXA-23(77.5%)、intl1(72.5%)，未檢測出KPC基因。每株CRAB菌株檢出2～8種耐藥基因，以檢出6種耐藥基因的菌株最多(37.5%)；檢出的耐藥基因組合中，以同時檢出ADC+OXA-23+OXA-51基因最多(29株，72.5%)，其次為ADC+intl1+qacE△1-sull基因(26株，65.0%)、ADC+qacE△1-sull+ant(3″)-Ⅰ基因(19株，47.5%)、ADC+OXA-23+OXA-51+intl1+qacE△1-sull基因(18株，45.0%)，11株(27.5%)同時檢出ADC+ant(3″)-Ⅰ+aac(3)-Ⅰ基因。見表3、圖1。

表3 40株CRAB 主要耐藥基因檢出情況

Table 3 Resistance of 40 strains of CRAB to commonly used antimicrobial agents

項目株數比率(%)耐藥基因 ADC40100.0 OXA-5136 90.0 qacE△1-sull32 80.0 OXA-2331 77.5 intl129 72.5 ant(3″)-I23 57.5 TEM23 57.5 aac(3)-I14 35.0 tnpu 6 15.0 traA 37.5 CTX-M-9 12.5耐藥基因種類(種) 212.5 4615.0 5512.5 61537.5 7717.5 8615.0

M:Marker；1、2、3、7、11分別為ADC、OXA-23、OXA-51、qacE△1-sull、TEM基因擴增結果

圖1 部分耐藥基因PCR擴增圖

Figure 1 PCR amplification map of partial resistance genes

2.4 PFGE分型結果 40株CRAB PFGE圖譜可見電泳條帶數在22～29條不等，見圖2。分為A1～A19 19種不同型帶，每種帶型包含菌株數為1～9株不等，其中菌株4、10、12、13、16、28、32、33、34為A5型，菌株1、8、17、20、29、35、37、38為A18型，菌株2、7、25、39、40為A9型，菌株15、23為A13型，菌株6、14為A17型，其余14種帶型分別只包含1株菌。多株為同一型者，主要來源于ICU、呼吸ICU、兒科ICU。見圖3。

M：DNA Marker；1～10：CRAB菌株

Figure 2 Electrophoresis map of PFGE of partial CRAB strains

圖3 40株CRAB的PFGE聚類樹圖

3 討論

CRAB是我國醫院感染重要的病原菌之一，隨著抗菌藥物和免疫抑制劑的廣泛使用，AB耐藥率逐年上升，嚴重威脅人類健康并成為日益嚴重的公共衛生問題[6]，尤其是ICU AB感染率及病死率均相對較高，已成為臨床治療的棘手問題。

CRAB對抗菌藥物耐藥機制具有多樣性和復雜性，耐藥機制主要包括;(1)產生碳青霉烯酶;(2)主動外排系統過度表達;(3)外膜孔蛋白下調或缺失;(4)抗菌藥物作用靶點發生改變;(5)形成生物膜;(6)多種可移動遺傳元件(整合子、插入序列、轉座子)傳播細菌的耐藥性等耐藥機制。碳青霉烯酶的產生是最常見也是最主要的耐藥機制。碳青霉烯酶按照Ambler分子分類法可分為4類，包括A(絲氨酸蛋白酶)、B(金屬β-內酰胺酶)、C(頭孢菌素酶)、D(苯唑西林酶)類。D類酶即OXA類酶,具有遺傳多樣性,主要包括OXA-23、OXA-58、OXA-24及OXA-51。研究[7]顯示，AB對碳青霉烯類耐藥與OXA-23家族的關系越來越密切。

OXA-51 和OXA-23檢出率分別為90.0%、77.5%，OXA-23基因檢出率與國內文獻[8]報道基本相近，未檢出新的亞型。CRAB出現與整合子對耐藥基因的積累有很大相關性,整合子是一種捕獲耐藥基因并可進行傳播的原件，存在于染色體，質粒或轉座子上。與AB耐藥有關的主要是Ⅰ～Ⅲ類整合子, 其中Ⅰ類整合子最多見.該院Ⅰ類整合子(intl1基因)檢出率為72.5%，與國內文獻[9]報道基本相似。

氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ⅰ和aac(3)-Ⅰ檢出率分別為57.5%、35.0%，文獻報道16S rRNA甲基化酶可引起細菌對氨基糖苷類抗生素耐藥[10],這類基因可通過多種途徑在菌株之間傳播，如轉座子、整合子及質粒等，有導致醫院內流行的可能[11]，且不同醫院或同一醫院的不同時間段氨基糖苷類耐藥基因流行情況是不完全相同的[12]。本研究結果顯示，同時含有氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-Ⅰ+aac(3)-Ⅰ CRAB菌株僅有11株，此類基因不是該院流行的主要耐藥基因。

消毒劑耐藥基因qacE△1-sull檢出率為80.0%，對于消毒劑耐藥基因目前研究最多的是季銨鹽類消毒劑耐藥基因， 即qac基因。qac基因家族包括qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacF 等[13]，臨床AB菌株攜帶qacE△1基因是普遍現象[14]，通過病原菌多種化合物外排泵基因表達而呈現耐藥。文獻[15]報道qacE△1-sull檢出率在90%以上，該院qacE△1-sull檢出率為80%,略低于文獻報道，但也應重視。本研究中整合子耐藥基因intl1檢出率為72.5%，整合子可使qacE△1-sull基因在AB之間進行基因傳播，推測該院qacE△1-sull基因檢出率高可能與整合子耐藥基因檢出率高有關。該院轉座子耐藥基因檢出率為15.0%，相對較低。TEM型β-內酰胺酶屬于廣譜β-內酰胺酶，其編碼基因位于耐藥質粒轉座子Tnl序列上，可以通過編碼質粒的接合轉移到其他細菌中，可水解第三代頭孢菌素，此也是近年來AB臨床分離株對頭孢類抗生素耐藥程度不斷增加的主要原因。ADC檢出率高達100%，說明ADC為AB的固有耐藥基因。研究[16]顯示，ADC當其編碼基因突變時將改變對藥物的水解能力。接合型質粒耐藥基因traA檢出率為7.5%。此次檢測并未發現新的耐藥基因型。

該院使用的氨基糖苷類抗生素是慶大霉素、妥布霉素、阿米卡星。本研究中40株CRAB對慶大霉素耐藥率高達95.0%，氨基糖苷類耐藥基因ant(3″)-I和aac(3)-Ⅰ檢出率分別為57.5%、35.0%，氨基糖苷類耐藥基因檢出率與對慶大霉素的耐藥率不完全一致，但與對阿米卡星、妥布霉素的耐藥率(分別為37%、55.6%)基本相符；對亞胺培南、美羅培南耐藥率均為100.0%，而碳青霉烯酶耐藥基因總檢出率小于90%，提示耐藥表型與耐藥基因存在差異[17]，AB耐藥機制復雜、多樣，差異的具體原因有待進一步研究。

PFGE被譽為分子分型的金標準，在同源性分析中被廣泛應用[18]。對該院收集的40株CRAB進行同源性分析，分為19種不同帶型,每種帶型菌株數1～9株不等，其中14種帶型(73.68%)分別只包含1株菌，其他5種(26.32%)帶型菌株數2～9株不等。39株菌相似性較高，相似度大于80%。對于相似度為100%的菌株可考慮為同一克隆株，通過聚類分析得出該院主要流行菌株以A5(9株)、A18(8株)型為主，這些菌株多數來自于ICU，說明該院有克隆株傳播。

本研究CRAB菌株量偏少，未對亞胺培南和美羅培南單藥耐藥的CRAB進行研究，可能會遺漏一部分因OXA-23基因缺失，導致AB對亞胺培南敏感性增加[19]的情況，后續將收集更多不同類型標本，進行耐藥性與耐藥基因關系以及同源性的分析。本研究未檢測出KPC基因，可考慮用KPC顯色平板法進行復核驗證。

綜上所述，該院CRAB耐藥形勢嚴峻，應加強醫院感染控制的主動監測，從而預防CRAB克隆株的播散。