不同絮凝劑對光合細菌沉降與凈水能力的影響

張秀霞 ，張澤龍 ，孫敬鋒 ，李軍濤 ，王冬梅 ，鄭佩華 ，魯耀鵬 ，冼健安 ，3

（1.天津市水產養殖與生態重點實驗室，天津農學院水產學院 天津 300384；2.中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所，海南省海洋生物資源功能性成分研究與利用重點實驗室，海南 海口 571101；3.中國熱帶農業科學院海南熱帶農業資源研究院，海南 海口 571101）

光合細菌（Photosynthetic bacteria,PSB）是一類具有光合色素，能在無氧條件下進行光合磷酸化的微生物。其分布廣泛，遍及江河、沼澤、湖泊、海洋、池塘及活性污泥和土壤中[1]。PSB最初應用于各類污水處理，后來逐漸引入應用到水產養殖中[2]。PSB在水產養殖上的研究和應用主要集中在調控、改善和穩定養殖水體的水質[3-8]，防治疾病的發生[9]以及利用PSB作為生物餌料和營養性添加劑等[10-11]。在PSB眾多的功能中，有關水質凈化功能的研究最為深入，應用效果已得到廣泛認同，PSB作為天然的微生態制劑，具有安全、高效、經濟和環保等優點。目前市場上的PSB凈水劑產品繁多，主要以沼澤紅假單胞菌為主，但由于缺乏質量標準，產品品質難以保障，存在活菌含量低、菌體活力低等問題，而PSB凈水劑的凈水效果與菌體的活力密切相關。另外，由于保持較好的活力狀態，PSB凈水劑產品均為液態產品，運輸成本較高。如果可將PSB菌液進行濃縮，同時又保持菌體高活力，則可大大降低成本，有利于促進PSB產品的推廣使用以及健康水產養殖模式的發展。張芳蕾等在PSB菌液中添加0.2%預先溶解糊化的海藻酸鈉靜置絮凝24 h，可得到濃縮10倍的絮凝菌劑[12]。黃業翔應用3%聚合氯化鋁（PAC）作為光合細菌絮凝劑，接近70%的光合細菌被絮凝沉降[13]。閆海等比較了4種不同鋁絮凝劑對光合細菌的絮凝效果，其中PAC的效果最好[14]。一些學者將PSB進行離心濃縮，再進行固定化后，水質凈化效果能夠顯著提高[15-16]。以往的學者對光合細菌絮凝劑已做了一些初步篩選，但在實際生產中仍未能得到應用。根據化學性質，絮凝劑可大致分為三類：無機絮凝劑、有機絮凝劑和生物絮凝劑，該研究比較三類絮凝劑對光合細菌的絮凝效果，確定適宜的絮凝劑及其適宜濃度與絮凝時間。通過絮凝沉降試驗，探討不同絮凝劑的沉降效果，并對沉降濃縮菌液的活性和凈水效果進行分析，篩選高效的絮凝劑，為光合細菌菌液產品的濃縮工藝研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

試驗PSB菌株是本實驗室篩選出的沼澤紅假單胞菌，其他主要試劑材料：聚合氯化鋁（PAC）和聚丙烯酰胺陽離子型（MW：800萬，CPAM）購于天津市大茂化學試劑廠，聚丙烯酰胺陰離子型（MW：800萬，APAM）購于MREDA，酵母采用進口費曼迪斯S-04艾爾啤酒酵母。

PSB培養基：無水乙酸鈉1.0 g/L，酵母膏1.0 g/L，氯化銨0.5 g/L，七水合硫酸鎂0.2 g/L，磷酸二氫鉀0.3 g/L，磷酸氫二鉀 0.3 g/L，氯化鈉 1.0 g/L，pH值7.2±0.2。

酵母培養基：蛋白胨20.0g/L，葡萄糖20.0g/L，酵母膏10.0g/L，pH 值 6.5±0.2。

PSB計數培養基[17]：碳酸氫鈉1.0 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，酵母膏2.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，Fe-EDTA0.005g/L，氯化銨1.0g/L，六水合氯化鎂0.2 g/L，氯化鈉 5.0g/L，瓊脂粉 18 g/L，pH 值 7.6±0.2。

1.2 四種絮凝劑的沉降效果試驗

1.2.1 光合細菌和酵母菌的活化 PSB培養基121℃，滅菌20 min，按20%接種量接種PSB菌液，于30℃，光強2 300 lx的智能光照培養箱中培養72～96 h，測OD660值為1.6～1.8，備用。酵母培養基121℃，滅菌20 min，按2%接種量接種酵母干粉，于27℃，250 r/min的搖床中培養72～96 h，菌液分裝至無菌離心管中，6 000 r/min離心5 min，去掉上清液收集沉淀，收集的沉淀用0.9%無菌生理鹽水洗滌2次。

1.2.2 絮凝劑沉降試驗 絮凝劑按要求稱量好，加入1L PSB菌液中充分攪拌使之完全溶解，溶解完畢取樣檢測OD660值，并將菌液倒入imhoff漏斗中靜置，觀察沉降效果，記錄沉降到目標時間沉降菌液體積，檢測上清液的OD660，計算絮凝率。根據實際靜置絮凝情況，PAC和CPAM組靜置絮凝1 h，APAM和酵母菌組靜置絮凝10 h。每組設置3個平行。

絮凝率=（混合均勻菌液OD660-上清液OD660）/混合均勻菌液OD660×100%

1.3 模擬養殖廢水培養液的配制

1.3.1 飼料浸出液母液 取市場上購買的對蝦飼料50 g加1 L海水，海水鹽度30，4℃冰箱浸泡過夜，用200目尼龍篩過濾3次，121℃，滅菌20 min，備用。

1.3.2 模擬養殖廢水培養液配制取 養殖廢水，要求氨氮與亞硝酸鹽在目標值以上，121℃，滅菌20 min，備用。用上述飼料浸出液母液加養殖廢水稀釋，配制成目標培養液，分裝至三角瓶，每瓶加400 mL培養液，121℃，滅菌20 min，備用。

1.4 沉降后的菌體活性測定

PSB計數培養基121℃，滅菌20 min，倒平板備用。根據1.2的結果選擇合適的絮凝劑及濃度進行試驗，方法同1.2，沉降到目標時間后用移液器小心吸出上清液，取底部沉降菌液檢測OD660，并將底部沉降菌液稀釋到合適倍數平板涂布檢測活菌數，每組設置3個平行。

1.5 沉降后的菌體凈水能力的測定

分別取不同濃度PAC沉降1 h的菌液20 μL添加至400 mL模擬養殖廢水中，添加20 μL未加絮凝劑的PSB菌液作為陽性對照組，不添加PSB菌液作為陰性對照組。每組設置3個平行。COD、氨氮和亞硝酸鹽均采用Lovibond水質分析儀及相應試劑盒進行測定。

COD 去除率=（初始 COD-檢測 COD）/初始COD×100%；

氨氮去除率=（初始氨氮-檢測氨氮）/初始氨氮×100%；

亞硝酸鹽去除率=（初始亞硝酸鹽-檢測亞硝酸鹽）/初始亞硝酸鹽×100%。

2 結果

2.1 四種絮凝劑的沉降效果

PSB菌液中添加PAC后，菌液迅速形成絮狀物并開始分層，絮狀物快速聚集沉降，隨著PAC濃度的增加，上清液顏色越來越淡，沉降菌液體積越來越大。PSB菌液中加入CPAM后，迅速形成較大塊的絮凝物，菌液變粘稠，絮凝物或沉于底部或粘附于imhoff漏斗壁或懸浮于液體中，晃動imhoff漏斗懸浮的絮狀物會逐漸沉于底部。PSB菌液中加入APAM后菌液變粘稠，有小絮狀物懸浮于菌液中但不沉降，底部有黏液狀透明物。PSB菌液中加入酵母菌后，菌液變渾濁，有顆粒狀絮凝物漂浮在菌液中，隨后緩慢沉降。四種絮凝劑對PSB的沉降效果如圖1。

加入PAC、APAM、酵母菌3種絮凝劑混合均勻后，OD值與對照組相比，均有不同程度的增加，其中添加酵母菌后，菌液變渾濁，OD值增加最大；添加CPAM混合均勻后，菌液迅速絮凝成塊狀物，菌液OD值降低。結果如表1，靜置30 min后，PAC組的沉降效果已十分明顯，最高絮凝率為96.13%；CPAM組也有明顯的沉降，最高絮凝率為39.06%，APAM和酵母菌組的沉降不明顯。與靜置沉降30 min相比，1 h后PAC和CPAM組的絮凝率有所增加，絮凝率最高分別為96.86%和42.20%。APAM組和酵母菌組的沉降時間延長至10 h，絮凝率為3.52%和34.96%。四種絮凝劑的絮凝率均隨絮凝劑添加濃度上升而增加。綜合總體情況，絮凝效果最好為濃度2 000 mg/L的PAC，靜置時間30 min。

2.2 PAC沉降濃縮菌液的菌體活性

根據2.1的結果，絮凝劑PAC對PSB的沉降效果最好，因此挑選PAC沉降濃縮1h的菌液進行活菌濃度測定，結果如表2，隨著PAC添加量的上升，菌液的OD660下降，活菌濃度也相應減少。500 mg/L的PAC組的活菌濃度最高，是對照組的19.9倍。菌液OD660和活菌濃度進行相關性分析，結果如圖2，菌液OD660和活菌濃度呈顯著的正相關線性關系，相關性系數R2=0.989。

2.3 PAC沉降濃縮菌液的凈水效果

取添加不同濃度PAC沉降濃縮1 h后的菌液進行凈水效果試驗，結果如圖3～圖6。沒有添加菌液的陰性對照組在5 d的試驗期內COD、氨氮和亞硝酸鹽均沒有顯著變化。添加非濃縮菌液的陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液的試驗組，COD均持續下降，前48 h下降迅速，而后逐漸趨緩。500 mg/L和1 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的COD降解速度較快，陽性對照組降解速度最慢。120 h后，各PAC濃縮菌液組之間的COD去除率差異無統計學意義，均顯著高于陽性對照組（圖3）。

表1 絮凝劑對光合細菌的絮凝效果

表2 PAC絮凝沉降1 h后濃縮菌液的OD值與活菌濃度

圖2 PAC沉降1 h后濃縮菌液的OD660和活菌濃度的線性關系

陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液組的氨氮含量均呈現先升高后下降的趨勢。陽性對照組氨氮含量在前72 h上升，96 h開始下降。PAC沉降濃縮菌液組氨氮含量在前48 h上升，72 h開始下降。120 h后，500 mg/L、1 000 mg/L和 1 500 mg/L的 PAC 濃縮菌液組的氨氮含量略低于初始值，其中500 mg/L的PAC濃縮菌液組的氨氮去除率最高，2 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的氨氮含量恢復到初始值水平，陽性對照組的氨氮含量仍顯著高于初始值（圖4）。

陽性對照組和PAC沉降濃縮菌液組的亞硝酸鹽含量均持續下降，且在48 h時亞硝酸鹽含量均已降至0.1 mg/L以下。前24 h，PAC沉降濃縮菌液組的亞硝酸鹽降解速度顯著高于陽性對照組（圖5）。

3 討論

3.1 不同絮凝劑對PSB的沉降效果

圖3 PAC沉降菌液對COD的降解效果

圖4 PAC沉降菌液對氨氮的降解效果

PAC是新型無機高分子絮凝劑，在水中發生水解反應生成中間產物，水體中的細微顆粒或膠體污染物在中間產物的作用下進行吸附電中和、吸附架橋或吸附卷掃等作用，使這些細微物質脫離穩定狀態，生成粗大的絮凝體，從而沉降下來[18]。該試驗中，PAC加入液相后，快速水解成Al(OH)3，在水中與PSB菌體所帶的負電荷瞬間產生中和作用而迅速絮凝，并進一步架橋生成大絮團而快速沉降。

圖5 PAC沉降菌液對亞硝酸鹽的降解效果

PAM為人工合成有機高分子絮凝劑，按其所帶電荷屬性可分為陽離子型、陰離子型、非離子型、兩性型四種類別，PAM絮凝主要通過電中和、吸附架橋或吸附卷掃等，使顆粒聚成較大的絮體，進而沉降[19]。PSB培養基pH值在7.4～8.0之間，大于氨基酸等電點，所以其表面帶負電荷，而該試驗中所用CPAM帶正電荷，與PSB能通過電中和吸附等作用形成較大絮凝體進而沉降；APAM帶負電，與PSB不能產生電中和作用，故只有小絮凝物，無法沉降。

絮凝是酵母的可遺傳特性之一，絮凝特性受絮凝基因控制，不同種酵母絮凝性不同[20]。酵母細胞壁上的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質和N-乙肽葡萄糖胺等成分均可用作絮凝劑。微生物絮凝機理被廣泛接受的主要有吸附架橋、吸附-電中和、沉析物網捕等[21-22]。該研究結果顯示，添加酵母對PSB具有一定的絮凝沉降作用，但效果較差，且所需的時間較長。

圖6 PAC沉降菌液的COD、氨氮和亞硝酸鹽去除率

比較4種絮凝劑，PAC對PSB的絮凝沉降效果最佳，沉降迅速，時間短。各類絮凝劑的添加濃度越高，絮凝率越高。PAC添加量為2 000 mg/L時，30 min的絮凝率即可達到96.13%。

3.2 PAC絮凝沉降對光合細菌菌體活力的影響

PAC添加量越高，絮凝率越高，但從表2可見，濃縮菌液中的菌體活力呈現了相反的趨勢，即單位體積菌液的活菌數量反而減少。在絮凝沉降過程中發現，PAC添加量越高，絮凝物沉淀部分的體積也越大，但結構變得松散，這可能是活菌濃度反而下降的主要原因；另外，PAC添加量是否對PSB產生毒性影響而降低活菌濃度，仍有待進一步研究。根據活菌濃度，PAC添加量以500 mg/L為宜，經濃縮后活菌濃度可達到原來的19.9倍。

3.3 PAC絮凝沉降對光合細菌凈水能力的影響

研究結果顯示，該試驗所用的PSB菌株對水體COD和亞硝酸鹽均有很強的降低能力，而氨氮則呈現了先升高后下降的趨勢。PSB既能利用無機氮源也能利用有機氮源，但菌體不能直接利用有機氮源，有機氮源需轉化為NH4+才能為細菌所用[23]。該研究結果表明，該菌株優先分解利用有機氮源，轉化有機氮源為NH4+，導致氨氮含量在試驗前期上升。48 h后，PAC濃縮菌液使COD降解約50%，此時COD的下降趨于緩慢，氨氮含量也開始下降。與未經濃縮的菌液對比，PAC濃縮菌液的COD降解速度略優，而氨氮含量由上升轉為下降則提前了24 h。在120 h后，陽性對照組的氨氮含量仍高于初始值，PAC濃縮菌液組的氨氮含量已恢復或低于初始水平。

亞硝酸鹽是水體主要毒性污染物之一，它對水產動物的危害主要表現在其會氧化水產動物體內的亞鐵血紅蛋白成為高鐵血紅蛋白，減弱血紅蛋白的攜氧能力，使水產動物缺氧[24]。光合細菌降解亞硝酸鹽是通過自身的代謝特征，將亞硝酸鹽轉化為硝酸鹽，試驗證明此菌株有很強的亞硝酸鹽降解能力，未經濃縮和PAC濃縮的菌液均在48 h時將亞硝酸鹽降解完畢。但從24 h數據可看出，經過PAC濃縮的菌液的亞硝酸鹽降解速度優于未經濃縮菌液。

對不同PAC添加量濃縮的菌液進行比較發現，500 mg/L和1 000 mg/L的PAC濃縮菌液組的COD降解速度略優于其他PAC添加量濃縮菌液組，500 mg/L的PAC濃縮菌液組的120 h氨氮去除率最高。這些結果與濃縮后菌體活力的檢測結果相一致，500 mg/L的PAC濃縮菌液的活菌濃度最高，因而凈化能力也較強。雖然提高PAC的添加量，能夠提高絮凝率，但活菌濃度以及凈水能力反而下降，因此建議選用PAC作為PSB沉降濃縮的絮凝劑，添加濃度以500 mg/L為宜，沉降濃縮時間為1 h。