微小RNA-155/含有SH2結構的5肌醇磷酸酶-1與非酒精性脂肪性肝病患者發生心血管事件的相關性

王 凡， 孫 武， 馬玉林， 蔣紅君

云南省第一人民醫院(昆明理工大學附屬醫院) 檢驗科， 昆明 650032

近年來，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)發病率呈逐年上升趨勢，已經成為臨床最為常見的非感染性肝臟疾病[1]。NAFLD是由非過度飲酒或其他明確肝損傷因素所導致的，以肝細胞內出現大量的脂肪沉積為主要特征[2]。研究[3]顯示，脂肪肝與心血管病之間存在著密切聯系。NAFLD是代謝綜合征在肝臟中的表現，而代謝綜合征是導致動脈粥樣硬化以及臨床心腦血管事件發生的主要原因之一[4]。有學者[5]提出，NAFLD不僅是心血管疾病的發生標志，甚至是心血管疾病的早期中間狀態。目前，微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)作為理想的心血管疾病標志物之一，對心血管疾病的早期診斷、臨床風險評估以及預后判斷等方面均具有重要作用[6-7]，本研究旨在分析miR-155及其靶基因含有SH2結構的5肌醇磷酸酶-1(SH2-containing inositol phosphatase-1, SHIP-1)與NAFLD患者心血管事件的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年3月-2019年7月本院收治的NAFLD患者，作為NAFLD組；并選擇同時期在本院健康體檢的健康志愿者作為對照組。納入標準：(1)符合2010年《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[8]中相關診斷標準；(2)對照組志愿者無內科相關疾病、代謝性疾病等。排除標準：(1)合并風濕性心臟病、瓣膜病、心肌病、肺心病患者；(2)合并酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷以及肝硬化等肝臟疾病患者；(3)合并惡性腫瘤、甲狀腺功能亢進、腎臟疾病或服用影響肝功能藥物患者；(4)妊娠期及哺乳期婦女。

1.2 方法

1.2.1 常規指標檢測 測量兩組受試者身高及體質量，計算BMI；測量血壓，包括收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP)；抽取兩組受試者清晨空腹靜脈血，檢測受試者空腹血糖(FPG)、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平。FPG檢測采用葡萄糖氧化酶偶聯比色法(GOD-POD法)，其余指標檢測采用全自動生化分析儀，檢測嚴格參照試劑盒使用說明書進行。

1.2.2 miR-155及SHIP-1 mRNA檢測 采用熒光定量PCR法檢測miR-155及SHIP-1 mRNA，采用Trizol法提取外周血全血總RNA，測定RNA濃度、純度以及完整性，采用TaKaRa公司RNA逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。采用引物設計軟件Premier5.0分別設計mRNA及基因熒光定量PCR引物，具體見表1，引物合成由上海生工生物技術有限公司完成。以25 μl/孔qPCR反應體系進行熒光定量PCR反應，包括12.5 μl SYBR Premix Ex TaqⅡ(2×)、1.0 μl Gol Forward Primer、1.0 μl Uni-miR qPCR Primer、0.5 μl ROX Reference Dye(50×)、2.0 μl cDNA溶液、8.0 μl dH2O。反應條件為95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s、60 ℃ 11 s共進行40個循環。PCR擴增產物進行瓊脂凝膠電泳，以GAPDH作為內參基因，采用△△Ct法計算基因相對表達量。

表1 PCR引物序列

1.3 倫理學審查 本研究已通過云南省第一人民醫院倫理委員會批準(批號：2017倫審第51號)，所有受試者均簽署知情同意書。

2 結果

2.1 一般資料 共納入NAFLD組104例，對照組110例。NAFLD組中男68例、女36例，年齡43～65歲，平均年齡(52.17±8.92)歲，病程3個月～16年，平均病程(4.18±1.39)年，病情輕度62例、中重度42例。對照組中男65例、女45例，年齡45～60歲，平均年齡(51.20±9.83)歲。經比較，兩組受試者性別、年齡差異均無統計學意義(P值均>0.05)，具有可比性。

2.2 兩組各指標比較 兩組SBP、DBP水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)，NAFLD組患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT、TBil水平明顯高于對照組，HDL-C水平明顯低于對照組，miR-155 mRNA相對表達量明顯高于對照組，SHIP-1 mRNA相對表達量明顯低于對照組，且miR-155/SHIP-1值、心血管事件發生率均明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P值均<0.01)(表2)。

2.3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD組患者各指標比較 參考文獻[6]，根據患者miR-155/SHIP-1值將患者分為3組，3組間DBP、SBP水平差異均無統計學意義(P值均>0.05)，而3組BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、GGT、TBil心血管事件比較差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表3)。

表2 兩組受試者各指標比較

表3 不同miR-155/SHIP-1值NAFLD組患者各指標比較

注：1)與≤2組比較,P<0.05；2)與2～3組比較,P<0.05。

表4 miR-155/SHIP-1值與各指標相關性分析

2.4 miR-155/SHIP-1值與各指標相關性分析 miR-155/SHIP-1值與BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT及TBil呈顯著正相關(P值均<0.05)，與HDL-C呈顯著負相關(P<0.05)(表4)。

2.5 miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發生預測價值 發生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值為3.642±1.082，未發生心血管事件的NAFLD患者miR-155/SHIP-1值為2.237±0.703，前者明顯高于后者，差異有統計學意義(t=11.104，P<0.05)。采用ROC曲線分析miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發生預測價值，ROC曲線下面積為0.902(圖1)。

3 討論

NAFLD是由于非酒精因素所導致的一類肝細胞內脂肪過度沉積型疾病，屬于一種代謝應激性肝損傷，具有較高的發生率，且患者可進一步發生成為肝硬化，需引起臨床工作者的重視[9]。近些年來，國內多項研究顯示NAFLD與心血管事件的發生具有密切聯系[10]。心血管事件發生的主要病理基礎為動脈粥樣硬化，分子生物學研究[11]顯示，NAFLD可通過過氧化應急、內分泌激素、炎癥以及糖脂代謝異常等多種途徑損傷機體動脈內膜，繼而導致動脈粥樣硬化的發生。目前，心血管事件已經成為NAFLD患者死亡的主要原因[12]。

miRNA屬于轉錄本長度在22～25 nt范圍內的非編碼RNA，可通過對靶基因轉錄和翻譯的調控來影響細胞的生化、分化、增殖以及凋亡。miR-155不僅能夠對機體進行免疫調控，同時還能夠參與機體的各種炎癥過程[13]。此外，在激活的免疫細胞中可發現miR-155高表達，并且通過免疫調節細胞分化以及細胞因子的分泌參與機體的免疫調控反應過程[14]。研究[15]顯示，miR-155與機體炎癥因子(包括IL-6、TNFα以及IFNγ)表達密切相關，miR-155表達的升高可能是嚴重心血管意外發生的重要機制之一。SHIP-1是miR-155重要的作用靶點，可抑制巨噬細胞所引發的炎癥反應。由于miR-155與SHIP-1 mRNA 3’端UTR相結合，當miR-155表達增高時，可導致SHIP-1表達的明顯降低[16-17]。有報道[18]miR-155/SHIP-1表達與經皮冠狀動脈介入術后患者嚴重心血管事件的發生密切相關，但是關于miR-155/SHIP-1表達與NAFLD患者心血管事件的發生關系，目前尚無相關報道。

本研究結果顯示，兩組受試者血壓SBP、DBP比較差異均無統計學意義，NAFLD組患者BMI、FPG、TC、TG、LDL-C、ALT、AST、GGT以及TBil明顯高于對照組，NAFLD組患者HDL-C水平明顯低于對照組；同時NAFLD組患者心血管事件發生率明顯高于對照組，上述結果與既往研究[19-20]結果相似，提示NAFLD患者出現糖脂代謝以及肝功能異常，且心血管事件發生率較正常健康人群明顯升高。此外，本研究結果提示NAFLD患者可見miR-155/SHIP-1表達異常，miR-155表達升高而SHIP-1表達降低。進一步分析miR-155/SHIP-1值與NAFLD患者糖脂代謝及心血管事件發生的相關性，結果顯示，NAFLD患者miR-155/SHIP-1表達異常與糖脂代謝及肝功能密切相關，可能是疾病進展的重要機制。采用ROC曲線分析miR-155/SHIP-1值對患者心血管事件發生預測價值，提示NAFLD患者miR-155/SHIP-1表達情況可有效預測患者心血管事件的發生，進一步顯示miR-155/SHIP-1在NAFLD患者心血管疾病進展過程中發揮著重要作用。

綜上所述，NAFLD患者出現明顯的糖脂代謝及miR-155/SHIP-1表達異常，其糖脂代謝及肝功能異常與miR-155/SHIP-1表達密切相關。因此，miR-155/SHIP-1表達可有效預測患者心血管事件發生。