免疫反應與炎癥損傷在肝衰竭發病機制中的作用

王挺帥， 王 娜， 張榮臻,， 王明剛， 黃少東， 馬玉珍， 吳 聰， 毛德文

1 湖南中醫藥大學 研究生學院， 長沙 410000; 2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院 肝病一區， 南寧 530023;3 廣西中醫藥大學 研究生學院， 南寧 530023

肝衰竭是多種因素引起的嚴重肝臟損傷，導致合成、解毒、代謝和生物轉化功能嚴重障礙或失代償，出現以黃疸、凝血功能障礙、肝腎綜合征、肝性腦病、腹水等為主要表現的一組臨床癥候群[1]。在我國引起肝衰竭的主要病因是肝炎病毒(主要是HBV)，其次是藥物及肝毒性物質(如乙醇、化學制劑等)[1-2]。基于病史、起病特點及病情進展速度，肝衰竭可分為4類：急性肝衰竭(ALF)、亞急性肝衰竭(SALF)、慢加急性(亞急性)肝衰竭(ACLF)和慢性肝衰竭(CLF)[1]。目前，肝衰竭的發病機制尚未完全明確，免疫損傷、缺血缺氧和內毒素血癥在肝衰竭發生、發展的過程中起著重要作用，主要通過兩條作用途徑：一是直接損傷肝細胞導致肝細胞死亡；二是激活體內免疫炎癥反應間接造成肝細胞損傷和死亡[3-5]。

近年來，越來越多的學者傾向于“以免疫炎癥損傷為核心的二次打擊學說”，即在病毒、病原體、毒性因子等對肝細胞直接損傷的基礎上，通過腸源性內毒素介導的“內毒素→免疫機制→細胞因子風暴”，產生過度、持久的免疫炎癥反應，進而對肝臟造成“二次打擊”，最終導致了肝衰竭的發生[6]。肝衰竭存在復雜的免疫、炎癥反應過程，肝臟固有免疫細胞可吞噬、殺傷病原體，從而維持內環境穩定；過度的免疫反應導致炎癥因子水平增加，進而促進炎癥因子風暴形成，加重肝衰竭；肝臟代償性免疫抑制，免疫功能紊亂導致患全身炎癥反應綜合征和膿毒癥風險提高。本文就免疫反應和炎癥損傷在肝衰竭發病機制中的作用進行綜述。

1 免疫調節與肝衰竭

肝臟在免疫調節和宿主防御中起著重要作用，既可保護宿主免受感染，也可防止微生物及其產物經胃腸道-門靜脈流入肝臟/體循環[7]。天然免疫系統是抵御病原體入侵和其他潛在威脅的第一道防線。多種天然免疫細胞間的精細協調對于有效地消滅和清除入侵病原體和其他分子威脅至關重要。肝臟富含天然免疫細胞，如巨噬細胞、Kupffer細胞、中性粒細胞、自然殺傷細胞(NK細胞)和樹突狀細胞(DC)等；適應性免疫細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、調節性T淋巴細胞(Treg)、輔助性T淋巴細胞(Th)17等，對微生物病原體及其產物有獨特的免疫反應，影響肝衰竭的發生發展過程。

1.1 先天性免疫

1.1.1 巨噬細胞 巨噬細胞是肝臟中重要的抗原遞呈細胞，Kupffer細胞占肝內巨噬細胞總數的80%～90%[8-9]。Kupffer細胞具有大量的病原識別受體(pattern recognition receptors, PRR)、補體受體和Fc受體，通過這些受體以增強吞噬活性和產生炎性細胞因子，在免疫調節、組織修復和肝臟再生等方面具有重要作用[10-11]。Toll樣受體4(TLR4)主要在巨噬細胞上表達，在介導巨噬細胞活化和促炎細胞因子的產生中起重要作用。無論什么原因所致肝衰竭都伴隨著腸上皮屏障完整性的破壞，無論是直接的細胞毒性或是腸道微生態紊亂，都會增加肝臟的負擔[12-13]。在ACLF過程中，PRR和損傷相關分子模式(damage associated molecular pattern, DAMP)聯合作用引起的損傷是導致ACLF多器官損傷和衰竭的主要原因，組織損傷和細胞死亡又可進一步加劇DAMP及炎癥狀態，造成惡性循環[14]。

1.1.2 中性粒細胞 中性粒細胞是血液中含量最豐富的天然免疫細胞，其吞噬和清除細菌病原體的能力是天然免疫的關鍵一環[15]。中性粒細胞可發揮胞外抗菌作用以限制各種抗菌性顆粒蛋白的擴散，從而減少中性粒細胞引起的組織損傷，但同時中性粒細胞的形成及清除障礙募集級聯反應又會加重炎癥損傷程度[16]。有研究[17]發現，ACLF患者中性粒細胞功能障礙與死亡率增加之間存在相關性。王福生教授團隊[18]發現ACLF患者(除外合并腹膜炎、肺炎、腸炎等感染)的中性粒細胞/淋巴細胞比值顯著高于健康對照組與慢性乙型肝炎組，且比值隨著臨床分期的加重而升高。因此，中性粒細胞上調促使慢性肝病患者易受感染，也可能促進胃腸道的失調，增加循環中的微生物或微生物成分的數量，從而使慢性肝病的不適狀態持續下去，有助于增加發展CLF、ACLF的風險。

1.1.3 自然殺傷細胞(NK細胞) NK細胞占肝臟淋巴細胞總數的一半，其數量遠高于在外周血中[19]。NK細胞可表達多種激活和抑制性免疫受體，是調節肝臟免疫活性的關鍵前哨細胞[20]。NK細胞在ACLF病理過程中的作用較復雜，一方面，活化的NK細胞可通過增強細胞毒性而導致肝細胞損傷和死亡[21]；另一方面，NK細胞功能減弱的ACLF患者由于免疫反應削弱而更易受感染[22]。有研究[23]發現，NK細胞在ALF和HBV-ACLF的發病機制中起著關鍵作用，大量NK細胞從外周血、脾臟和骨髓中進入肝臟；同時，隨著細胞內IFNγ和TNFα的產生，NK細胞的細胞毒活性也顯著增強；其中Fas/FasL和NKG2D/NKG2D配體通路參與了肝臟NK細胞介導的肝細胞損傷。

1.1.4 樹突狀細胞(DC) DC是一種特異性抗原遞呈細胞，在肝臟中較為豐富。在正常生理條件下，肝內DC可以維持肝臟的免疫耐受環境；當病毒等病原體感染后，過量的免疫反應又可致肝損傷[24]。DC主要分為2種：髓樣DC和漿性DC，前者主要發揮抗原遞呈功能，后者在于局部的免疫調節作用。李保森等[25]發現HBV-ACLF患者肝內浸潤大量的漿性DC和髓樣DC，并優先分泌IL-10，發揮局部的免疫調節作用。除此之外，DC細胞有趨炎性效應，炎性組織中趨化因子的分泌增加可誘導DC的移位和聚集，髓樣DC可以通過激活初始T淋巴細胞分化成Th1或Th17，從而增強肝臟的免疫應答；然而，調節性DC由于表面分子表達量低，會誘導初始T淋巴細胞向Treg分化，起反向調控免疫反應的作用，導致免疫耐受或不應答[26-27]。

1.2 適應性免疫

1.2.1 T淋巴細胞 T淋巴細胞是來源于骨髓的多能干細胞(胚胎期則來源于卵黃囊和肝)，在胸腺內發育為T淋巴細胞，隨后移行至外周免疫器官的胸腺依賴區定居，并可經淋巴管、外周血和組織液等進行再循環，發揮免疫調節功能[28]。依據T淋巴細胞表面標志物及生物學功能的不同，可分為多種亞群，包括Th、抑制性T淋巴細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)等[29]。與肝衰竭存活組相比較，肝衰竭死亡組患者外周血CD3+、CD8+T淋巴細胞和CD4+/CD25+Treg比值降低更顯著，提示肝衰竭的發生發展過程與免疫功能密切相關[30]。

1.2.2 調節性T淋巴細胞(Treg) Treg在調控肝臟免疫應答中也起著至關重要的作用。CD4+CD25+Treg可通過TGF依賴性途徑限制ConA致肝損傷模型的肝損傷，IL-10也可通過表達CD4+CD25+Treg和Kupffer細胞，在ConA致肝損傷的肝臟耐受誘導中起重要作用[31]。Stoop等[32]研究發現，慢性乙型肝炎患者外周血CD4+T淋巴細胞中Treg比例明顯高于恢復期患者和健康人群，且Treg的比例及數量與血清HBV DNA的含量呈正相關；同時Treg能抑制HBV特異性T淋巴細胞反應，促進HBV持續慢性感染。在ACLF患者中，外周血CD4+CD25+Treg數量明顯低于HBV感染者，提示ACLF的發病機制可能由于患者外周血CD4+CD25+Treg數量過低從而引起CTL擴增失去控制，激發強烈的CD8+CTL反應，從而導致大量的肝細胞壞死，最終觸發凋亡機制引起肝細胞大量凋亡[33-34]。

1.2.3 輔助性T淋巴細胞(Th)17 Th17主要是在TGF和IL-6共同誘導下分化產生的，通過分泌細胞因子(主要為IL-17、IL-21、IL-22)以促進中性粒細胞的動員、招募及活化，從而介導促炎反應[35]。Th17和Treg不僅在發育過程中，而且在其效應功能上也存在相互關系。TGFβ可誘導Treg特異性轉錄因子Forkhead box P3(FOXP3)，而TGFβ中加入IL-6可抑制Treg的生成，誘導Th17，這提示Th17/Treg之間的良好平衡是維持免疫穩態的關鍵[36]。Zhai等[37]研究顯示，ACLF患者外周血Th17和FoxP3(+)Treg均增加，且Th17與Treg的比值與ACLF患者的生存率成反比。有研究[38]發現，Th17相關的炎癥與抗原遞呈細胞分泌的IL-23水平呈正相關，IL-23是Th17擴增及維持促炎性應答所必需的細胞因子。

2 炎癥反應與肝衰竭

炎癥反應在肝衰竭的發生發展過程中起重要作用[39]。ACLF患者血清中多種促炎細胞因子(包括TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8和單核細胞趨化蛋白1)水平明顯升高；同時，抗內擾介質如IL-10升高，但抗內擾代償機制不足以抵消刺激反應拮抗肝衰竭的進程[40]。目前認為，炎癥反應通路可概括為“炎癥誘導物→感受細胞→炎癥介質→靶組織”4個步驟。炎癥反應是一個多因素-多細胞-多通路-多層次的復雜病理生理反應，且與肝臟的免疫調節密切相關。

2.1 炎癥誘導物 外源性炎癥誘導物主要為病原體相關分子模式，是致病微生物的一些高度保守成分，如脂多糖、肽聚糖、脂蛋白、細菌DNA和病毒雙鏈RNA等[41]。病原體相關分子模式可通過PRR識別刺激信號級聯，匯集并激活NF-κB、IFN、激活蛋白1(AP-1)等轉錄因子，激活的轉錄因子誘導了多種基因，編碼抗菌效應物、細胞因子和趨化因子等，這些基因與誘導免疫反應有關[42-43]。PRR主要有4個亞家族：TLR、NLR、維甲酸誘導基因1樣受體和C型凝集素受體，PRR與先天性免疫細胞的結合誘導了適應性免疫細胞的共刺激信號[44-45]。TLR是一類高度保守的PRR，能夠識別PAMP從而迅速啟動免疫反應來抵抗入侵的病原微生物[46]。TLR4能特異性地識別PAMP，通過跨膜結構將病原相關分子刺激信號轉導入細胞內，產生復雜的級聯信號反應，激活NF-κB，釋放內源性致炎因子TNFα、IL-1、IL-6等，誘導肝細胞壞死和凋亡，趨化中性粒細胞和淋巴細胞浸潤，加重肝細胞損傷[47]。NLR基因家族的一些成員，例如NLRP3(由NLRP3、ASC和Caspase-1構成)，參與了“炎癥體”大分子蛋白質復合物的組裝，這種復合物可激活炎癥半胱氨酸蛋白酶Caspase-1切割pro-IL-1β或pro-IL-18，導致這些炎癥細胞因子的成熟和分泌[48]。

內源性炎癥誘導物是在組織或細胞損傷的情況下產生的，包括壞死細胞釋放的分子和細胞外基質分解的產物，這些內源性的炎癥誘導因子被稱為DAMP[49]。在生理狀態下，DAMP分子大多數存在于細胞中并起到維持細胞正常功能的作用；但細胞激活或受損、壞死后，DAMP可從被激活的免疫細胞或壞死細胞、細胞外基質中被釋放出來，從而識別危險信號、刺激炎癥反應、調節免疫過程等[50-51]。DAMP分子IL-33可協同脂多糖促進TNFα、IL-6、IL-1β等促炎活性，且IL-33的表達增加與HBV-ACLF的嚴重程度呈正相關[52]。

肝臟炎癥可由各種DAMP和PAMP引起，是多種肝病(包括ALF、ACLF、肝硬化、酒精性肝病、肝纖維化和癌癥等)免疫病理學的主要組成部分。對乙酰氨基酚致ALF導致肝細胞氧化應激和線粒體損傷，從而釋放出可被Kupffer細胞識別的PAMP；反過來，活化的Kupffer細胞又可分泌促炎細胞因子(如TNFα)、活性氧和趨化因子(如CCL2)，放大促炎信號，增加骨髓源性細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)進入肝臟的募集，從而增強炎癥過程[53]。高遷移率族蛋白B1(HMGB-1)是最具特征的DAMP之一，在細胞壞死過程中，隨著細胞膜完整性的喪失，HMGB-1被釋放到局部組織環境和循環中，通過Kupffer細胞上的TLR4和晚期糖基化終產物受體上調NF-κB依賴的促炎細胞因子的分泌[54]。乙酰化HMGB-1可由激活的單核細胞和巨噬細胞分泌，高水平的HMGB-1和乙酰化HMGB-1與ALF患者預后不良相關[55]。

2.2 炎癥介質

2.2.1 腫瘤壞死因子α(TNFα) TNFα在肝臟中主要由巨噬細胞(Kupffer細胞)產生，具有免疫調節和促炎活性，既可促使炎癥細胞募集、增強活性，從而啟動瀑布式炎癥級聯反應，又可促進肝細胞增殖，在肝再生過程中起著中心作用[56]。在肝衰竭過程中，TNFα是促進還是抑制肝細胞增殖，是拮抗還是加重肝衰竭，這是由發病時期、病情進展程度等決定。在肝損傷早期，高濃度的TNFα可保護肝細胞、促進肝細胞修復和再生；然而，持續增加的TNFα反而會誘導肝細胞的凋亡，加重肝損傷[57]。近年來，“內毒素-巨噬細胞-炎癥因子風暴”的肝衰竭發病機制受到了高度重視，而TNFα是由內毒素刺激產生的重要促炎細胞因子。在肝衰竭發生過程中，TNFα可直接損害肝細胞，又可通過促進炎癥因子的釋放，激活炎癥級聯反應，從而加重肝細胞壞死；可誘發中性粒細胞向內皮細胞黏附或活化中性粒細胞，促使其趨化聚集于肝臟，釋放蛋白酶或氧自由基造成肝細胞損傷；可引起血管內皮細胞損傷，微循環功能紊亂，導致缺血性肝細胞壞死[5]。

2.2.2 白細胞介素1(IL-1) IL-1超家族可分為3部分，包括IL-1亞家族[IL-1α、IL-β、IL-33和IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)]、IL-18亞家族(IL-18和IL-37)及IL-36亞家族(IL-36α、β、γ和IL-38)。上述的所有受體均為雜多聚體，其中至少有1個亞單位是IL-1受體家族的成員，其特征是胞外免疫球蛋白樣結構域和胞內Toll/IL-1R(TIR)結構域。細胞刺激后，IL-1R亞單位通過TIR結構域寡聚，隨后MyD88與TIR結構域結合，觸發NF-κB向細胞核的轉移，激活MAPK(如p38和c-Jun氨基末端激酶)，從而導致促炎反應[57]。IL-1Ra可與IL-1R競爭性結合，阻斷IL-1引發的信號傳遞從而起到抗炎作用。有研究[58]表明，IL-1Ra可通過抑制炎癥反應,減少肝細胞凋亡,促進肝細胞修復和再生,拮抗肝衰竭。 IL-18能夠誘導Th1、NK細胞、NKT細胞等增殖，并具有抗感染、介導炎癥反應等多種生物學活性，在先天性和后天性免疫中起著重要的作用。IL-18可促進Th1亞群分化誘導產生大量INFγ、TNFα、FasL和穿孔素等，增強NK細胞和CTL殺傷肝細胞活性，導致肝衰竭[50]。IL-32可促使TNFα、IL-1β、IL-8等炎癥介質或趨化因子的釋放，介導免疫損傷，加重炎癥反應[59]。

綜上所述，肝衰竭是臨床上常見而嚴重的臨床癥候群，其病情進展迅速、預后差、病死率極高。先天性免疫和適應性免疫都參與免疫介導的肝損傷，與肝衰竭的發病機制密切相關。炎癥反應是由炎癥誘導物→感受細胞→炎癥介質→靶組織構成的復雜過程，又與免疫反應密切相關共同參與肝衰竭的發生發展過程。宿主免疫反應與炎癥級聯反應在肝衰竭發病機制中極為重要，研究其作用機制對于提高臨床診療水平、研發新藥(例如TLR4拮抗劑、腸道失調調節劑、FXR激動劑、TNFα拮抗劑等)有著重要的意義。