徐州地區HBV感染者逆轉錄聚合酶區基因耐藥變異特點及耐藥影響因素分析

李 莎， 彭華彬， 李淑芹， 周 靜， 汪莉萍

徐州醫科大學附屬醫院 感染性疾病科， 江蘇 徐州 221002

HBV感染是一個重要的全球性問題，是導致乙型肝炎肝硬化(LC)和肝細胞癌(HCC)的主要原因[1]。長期使用核苷(酸)類藥物(NAs)可通過抑制HBV復制來降低此類疾病的發生[2]。然而，NAs很少能實現慢性HBV感染的功能性治愈[3][即：停止治療后仍保持HBsAg陰性(伴或不伴抗-HBs出現)、HBV DNA檢測不到、肝臟生物化學指標正常、肝臟組織病變改善]，大多數患者需終生服用NAs，其治療的最大障礙是不能根治乙型肝炎和易產生病毒耐藥。NAs治療失敗與HBV DNA逆轉錄聚合酶(reverse transcription polymerase，RT)區域的突變有關。HBV基因型耐藥突變分為兩種類型[4]：原發耐藥變異和補償變異，前者包括RT區中的rtA181V/T、rtM204I/V/S、rtN236T和rtM250V/L等相關突變，是導致NAs治療敏感性降低的主要原因。后者包括RT區中的rtVl73L、rtLl80M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtV214A、rtQ215S、rtL233V和rtN238H等相關突變，可以恢復RT活性，該變異主要由原發耐藥變異引起。因此，HBV的復制潛力[5]可以通過補償變異得以不斷維持。隨著NAs的廣泛應用，耐藥突變模式變得越來越復雜，NAs新的可疑耐藥位點不斷被發現。深入了解HBV感染者RT區變異特點和分析影響耐藥的危險因素至關重要，可為國家和本地區抗病毒治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2014年5月-2019年4月于徐州醫科大學附屬醫院感染科實驗室行HBV RT區基因序列檢測的患者。所有病例均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新)》[6]診斷標準，同時排除合并其他嗜肝病毒感染或人類免疫缺陷病毒感染者、自身免疫性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪肝、血吸蟲性肝硬化、藥物性肝損傷及遺傳代謝性肝病等其他可能引起肝損傷的疾病。既往是否使用過NAs或PEG-IFNɑ不作為本研究的排除標準。

1.2 研究方法

1.2.1 病毒學與生化學指標檢測 血清標志物檢測：采用美國Abbott I2000全自動微粒子化學發光免疫分析儀定量檢測。HBsAg檢測范圍為(0.05～250)IU/ml，大于250 IU/ml時采用1∶500自動稀釋檢測，HBeAg檢測下限為0.50 PEIU/ml，小于0.50 PEIU/ml定義為HBeAg陰性。HBV DNA檢測：采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀定量測定HBV DNA，檢測下限為 500 IU/ml。生化學指標檢測：采用Beckman Coulter AU5800全自動生化分析儀檢測。ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil(正常值參考范圍分別為 9～50 U/L、15～40 U/L、10～60 U/L、42～128 U/L、40～55 g/L、0～20 μmol/L)。上述指標均為患者行HBV RT區基因序列檢測時的同步實驗室數據。

1.2.2 HBV耐藥基因突變位點檢測及基因型檢測 HBV耐藥基因突變位點檢測：利用ABI基因測序儀3130對HBV DNA>1.0×103拷貝/ml的標本進行檢測。已知拉米夫定(LAM)耐藥位點：rtV173L、rtL180M、rtM204I/V/S、rtV207I/L/G、rtS213T；阿德福韋酯(ADV)耐藥位點：rtA181V/T/S、rtV214A、rtQ215S、rtN236T、rtP237H、rtN/H238T/D；恩替卡韋(ETV)耐藥位點：rtI169M、rtT184A/G/I/S、rtS202G/I、rtM204V/I、rtM250V/L；替比夫定(LDT)耐藥位點：rtL180M、rtM204I/V/S；替諾福韋酯(TDF)耐藥位點：rtP177G、rtA194T、rtF249A、rtA181V/T、rtN236T。HBV基因型分析：采用Chromas2.0軟件對HBV DNA P基因片段核苷酸編碼氨基酸的差異和變異類型進行分析，將測序結果與Genbank中已知的HBV不同基因型野生株序列進行比較，從而確認感染的HBV基因型。

1.3 倫理學審查 本研究已通過徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準(批號XYFY2020-KL081)。

2 結果

2.1 HBV耐藥突變模式分析 本研究共納入242例患者，男192例，女50例，年齡14～81歲，平均年齡44.51歲。其中118例患者有明確NAs用藥史且發生已知耐藥位點變異，在118例患者中共檢出35種不同的HBV耐藥突變模式，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S、rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S 檢出頻率多見。其中，單位點突變45例，雙位點41例，其余32例為多位點突變。已知耐藥位點變異發生在B基因型4例，C基因型114例，未發現其他基因型(表1)。

2.2 不同HBV基因型患者臨床特征分析 入組的242例患者中，B基因型13例，C基因型229例。其中B基因型患者ALT水平明顯高于C基因型，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各項指標組間比較差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

表1 118例患者耐藥突變模式

2.3 不同HBeAg狀態患者臨床特征分析 入組的242例患者中，HBeAg陰性66例，HBeAg陽性176例。HBeAg陰性患者年齡明顯高于HBeAg陽性患者，HBV DNA、HBsAg明顯低于HBeAg陽性患者，差異有統計學意義(P值均<0.05)。HBeAg陰性患者CHB人數所占比例低于HBeAg陽性患者，LC、HCC人數所占比例高于HBeAg陽性患者，差異有統計學意義(P<0.05)。HBeAg陰性患者病程、GGT水平明顯高于HBeAg陽性患者，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表3)。

表2 HBV 感染者B、C基因型臨床特征分析

表3 HBeAg陰性、HBeAg陽性HBV 感染者臨床特征分析

2.4 影響HBV RT區耐藥變異的危險因素 在242例HBV 感染者中，除118例有明確NAs用藥史且發生已知耐藥位點變異外，另有46例既往有明確NAs用藥史，但未發生已知耐藥位點變異，將這164例納入影響HBV RT區耐藥變異的危險因素分析中。以患者是否耐藥為因變量，分別以性別、年齡、診斷、病史、家族史、基因型、HBeAg、HBsAg、HBV DNA、ALT、AST、GGT、ALP、Alb、TBil、用藥情況、療程、服藥情況為自變量。建立二元logistic回歸模型。結果顯示，家族史、ALT、AST、GGT、Alb、用藥情況、服藥情況在模型中均有統計學意義(P值均<0.05)(表4)。

表4 影響患者耐藥的單因素logistic回歸分析

將上述單因素分析中有統計學意義的變量進行多因素logistic回歸分析，結果顯示，GGT、用藥情況、服藥情況在模型中差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表5)。GGT>60 U/L的患者發生耐藥的風險是GGT≤60 U/L患者的0.160倍；相對于ETV，LAM+ADV、ADV發生耐藥的風險分別是ETV用藥患者的0.080倍、5.493倍；相對于持續抗病毒治療，不適當停藥患者發生耐藥的風險是其5.945倍。

表5 影響患者耐藥的多因素logistic回歸分析

2.5 17例預存耐藥患者的基因型及變異情況 在242例HBV 感染者中，共檢出17例臨床資料完整的預存耐藥患者，呈現出9種不同的耐藥變異模式，以rtS213T最多見。其中與LAM相關的耐藥變異為9例，與ADV相關的耐藥變異為6例，與二者均相關耐藥變異有2例，耐藥模式為 rtS213 T+ rtV214A。已知耐藥位點變異發生在B基因型2例，C基因型15例，未發現其他基因型(表6)。

3 討論

由于cccDNA和整合HBV DNA的持續存在，慢性HBV感染無法徹底根除，現有抗病毒藥物包括NAs或PEG-IFNɑ[7]，二者實現慢性乙型肝炎臨床治愈的作用有限。通過對HBV RT區耐藥變異特點及相關影響因素的深入分析，可為HBV防治策略更新、新藥研制及疫苗研發提供及時可靠的理論依據。

Zhang等[8]調查了中國華北地區行NAs治療的4055例HBV感染者，結果表明，rtM204I/V/S發生頻率最高(13.44%，545/4055)，并且在過去7年中(2010年-2016年)，rtL180M和rtA181T/V逐漸增加，而rtM204I/V/S和rtN236T在2015年之后明顯下降。同樣，Qian等[9]的研究分析也顯示rtM204I/V/S突變的發生率在接受NAs的CHB患者中最高(34.53%，48/138)。本研究的起止時間為2014年-2019年，在118例有明確NAs用藥史且發生已知耐藥位點變異的患者中，以rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S較為多見，與上述研究結果基本一致。我國慢性乙型肝炎患者的NAs治療中，存在很多不規范治療的情況[10],這直接導致ETV耐藥頻率隨著時間推移明顯增加。本實驗中，ETV耐藥發生率高達21%(25/118),主要變異模式為rtL180M+rtS202G/I+rtM204I/V/S(7/25)、rtL180M+rtT184A/G/I/S+rtM204I/V/S(4/25)。有研究[11]表明，rtL180M+rtA181C+rtM204V在臨床中可能會引起ETV耐藥，rtA181V和(或)rtN236T可使TDF的敏感性下降3～13倍[12-13]，更嚴峻的是，有報道[14]提示rtA181T/V可能會導致肝癌的發生。目前各大指南[15-16]均推薦ETV和TDF作為一線HBV抗病毒藥物，rtL180M和rtA181T/V的增長趨勢表明二者未來將面臨的巨大挑戰。因此更應該注重HBV RT區基因序列的檢測，以便更好的調整優化治療方案。另外，本地區HBV基因型以C基因型為主，B基因型較少，這與中國北方以C基因型為主基本一致。

表6 17例患者的基因型及變異情況

本研究中，B基因型與C基因型HBV感染者僅在ALT水平存在差異，B基因型患者ALT水平明顯高于C基因型。有研究者[17]認為HBV基因型與所致疾病臨床特征之間沒有顯著關聯，而另一項在肝硬化患者的研究[18]中表明B基因型患者ALT及TBil升高程度比C基因型者明顯, 提示B基因型患者的肝損傷程度較C基因型患者嚴重。本研究中B基因型患者僅有13例，明顯低于C基因型患者(229例)，若能擴大樣本量則可使研究結果更具參考價值。本研究亦顯示，HBeAg陽性患者的HBV DNA、HBsAg、GGT水平均高于HBeAg陰性患者，與鮑騰等[19]的結果相似。這可能與HBeAg陽性患者體內以HBV復制活躍的野生株為主，而HBeAg陰性患者以HBV前C區變異株或C區啟動子雙變異株為主有關。此外，HBeAg陰性患者的年齡、病程、LC及HCC例數所占比例均高于HBeAg陽性患者，說明隨著感染時間的延長，HBV造成的肝損傷程度加重。

對影響耐藥的多因素logistic回歸分析分析顯示，應用ADV治療、不適當停藥是發生耐藥的獨立危險因素。正常人血清中GGT主要來自肝臟，各種原因導致的肝內外膽汁淤積時可以顯著升高。本研究提示高GGT水平引起患者耐藥風險降低，其機制有待深入探究。胡高飛等[20]發現NAs不適當停藥易誘發慢加急性肝衰竭，長期規范抗病毒治療對肝硬化患者尤為重要。有學者[21]指出，病毒學突破可由耐藥和依從性低下共同導致。本研究表明，不適當停藥會使患者耐藥風險明顯升高，這提示了在臨床工作中，需密切關注患者治療依從性問題，確保患者已經了解隨意停藥可能導致的風險。此外，現已不推薦低耐藥基因屏障藥物LAM、ADV作為抗病毒藥物首選。多項研究[22-24]表明，HBV DNA也是影響患者是否發生耐藥的危險因素，而在本實驗中，差異卻無統計學意義，可能與病例選擇、樣本量少等有關，未來尚需進一步動態觀察研究。在本研究中，還發現了17例臨床資料完整的預存耐藥患者，以C基因型、rtS213T和rtV214A耐藥模式多見，且以補償變異為主。

本研究尚存在一定不足，通過直接測序法檢測到的病毒種群在病毒準種中通常>20%，這必定會使部分耐藥位點無法檢出。未來可使用更靈敏的檢測方法，如超深度焦磷酸測序法，以實現更高的突變檢測率。綜上，本地區HBV感染者RT區變異以C基因型、rtL180M+rtM204I/V/S、rtA181T/V、rtM204I/V/S多見。B基因型患者的肝損傷程度較嚴重。應關注HBeAg陽性患者的HBsAg、HBV DNA水平。對應用ADV治療的患者，應高度警惕耐藥的發生，同時加強對抗病毒治療的依從性。在NAs治療失敗的患者中，應綜合各方因素考慮換用高效低耐藥NAs如TDF、TAF或聯合IFN治療。對是否在應用NAs抗病毒治療之前行HBV RT區基因耐藥檢測，仍需進一步開展大樣本、多中心研究明確。