E2F-1過表達對結直腸癌細胞預后的影響

徐君毅，以 敏，宋學民

（廣西醫科大學第四附屬醫院，廣西 柳州 545005）

E2F-1參與構成轉錄因子復合物，調控多種靶基因參與轉錄進程，在細胞周期進展中具有重要作用。E2F-1與胃癌、結腸癌等多種消化道腫瘤的發生也存在密切相關性[1-2]，穩定的E2F-1過表達可抑制MGC-803胃癌細胞的增殖過程[3]。為研究E2F-1與結直腸癌的關系，我們檢測了結腸癌標本中E2F-1的表達情況，并構建E2F-1真核載體，轉染結腸癌LoVo細胞株，初步探討E2F-1過表達對結腸癌細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 標本采集

收取廣西醫科大學第四附屬醫院胃腸外科原發性結直腸癌手術切除標本，同時收取腫瘤組織和距腫瘤邊緣5 cm以上正常組織，分別作為腫瘤組和對照組，每組各35例。腫瘤組標本均需經病理明確診斷，對照組標本病理證實無腫瘤細胞浸潤。所有采集標本離體30分鐘內投入液氮中速凍10 min，然后送入-70℃冰箱保存。

1.2 主要材料

結腸癌LoVo細胞株（中科院上海細胞所），鼠抗人E2F-1單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），免疫組化試劑和Western blot實驗試劑（武漢博士德公司），pCMV-HA真核載體（美國Clontech公司），引物由上海生工合成。

1.3 Western blot

取出腫瘤組和對照組組織標本，病理冰凍切片機上切成40～50 μm薄片，組織裂解法抽提組織標本核蛋白，采用Bradford調整各組蛋白濃度一致。經SDS-PAGE凝膠電泳分離，電轉至甲醛預處理過的PVDF膜，封閉液密封2 h，加入鼠抗人E2F-1一抗（1:200）4℃孵育過夜，TBST漂洗60 min。加入HRP標記的山羊抗鼠二抗（1:1000），25℃孵育1 h，TBST漂洗60 min。使用DAB顯色試劑盒進行顯色后，暗室曝光到X線片上，采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。內參蛋白為β-actin，以E2F-1與β-actin比值代表E2F-1表達水平。

1.4 E2F-1真核表達質粒的構建和細胞轉染

1.4.1 引物設計與合成。依據GeneBank中E2F-1 DNA序列（登錄號：NM_005225.1），Primer Premier 5.0 軟件設計引物。第二對引物兩端包含EcoRⅠ酶切位點。

上游引物 下游引物 產物長度第一對 5’GGACTTTGCAGGCAGCGGCG3’ 5’CTGGAAACCCTGGTCCCT CCAAGC3’ 1462bp第二對 5’GAATTCATGGCCTTGGCCGGGGC3’ 5’GAATTCTCAGAAATCCAGGGGGGTG 3’ 1326bp

1.4.2 采用二次PCR的方法擴增E2F-1完整序列。第一次PCR以人肝臟細胞E2F-1 mRNA作為模板，擴增產物長度1462 bp。第二次PCR以第一次PCR產物為模板，產物長度為1326 bp。二次PCR后，產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.4.3 真核表達載體的構建。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳回收并純化后，EcoRⅠ內切酶進行酶切，獲得E2F-1全序列片段，然后連接至pCMV-HA質粒，篩選陽性表達質粒酶切后電泳鑒定，并送上海生工測序驗證。

1.4.4 結腸癌LoVo細胞株的培養和質粒轉染。細胞培養條件：37℃，5%CO2的溫箱，含10%小牛血清的RPMI-1640培養基。將構建成功的真核表達質粒和脂質體均勻混合，室溫靜置20 min后加入細胞培養基中進行轉染。24 h、48 h后收集細胞，提取總蛋白，Western Blot分析驗證，確認能穩定表達E2F-1蛋白。

1.4.5 細胞克隆形成實驗：取E2F-1真核表達質粒轉染的LoVo細胞和空轉的LoVo細胞，制成細胞懸液后按梯度倍數稀釋，接種于6孔板，培養14天。固定細胞后，適量GIMSA染色液染色，顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數，計算克隆形成率。

1.4.6 細胞生長曲線（MTS法）：取穩定表達E2F-1基因的LoVo細胞和空載體轉染的LoVo細胞，用含10%小牛血清的培養液配成單個細胞懸液，接種到96孔板，每孔體積100ul，持續培養7天。呈色時每孔加MTS溶液20 ul，繼續孵育2 h，測定490 nm波長吸收值。所記錄結果以培養時間為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制細胞生長曲線。

1.5 統計方法

采用SPSS 19.0進行數據分析，Western blot結果行成對樣本t檢驗，P＜0.05代表差異有統計學意義；細胞克隆形成實驗和細胞生長曲線結果采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05代表差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Western blot結果

采用Imaging System軟件分析各組條帶灰度值，依據相對灰度值進行統計學分析。以E2F-1與β-actin條帶比值代表E2F-1表達水平。腫瘤組與對照組平均表達水平分別為1.043±0.212和0.590±0.177，屬于服從正態分布的連續型實驗數據，采用配對t檢驗，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2 E2F-1穩定過表達對結腸癌LoVo細胞株的影響

2.2.1 細胞克隆形成實驗：轉染并過表達E2F-1蛋白的結腸癌LoVo細胞形成的克隆數量明顯少于轉染空載質粒的LoVo細胞，兩組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。（見圖1）。

2.2.2 細胞生長曲線（MTS法）：活細胞的數量與490nm吸光度成正比，統計結果顯示過表達E2F-1的LoVo細胞繁殖速度受到抑制，明顯慢于對照組LoVo細胞，兩組間差異具有統計學意義(P＜0.05)。（見圖2）。

圖1 克隆形成實驗結果

圖2 MTS法繪制的細胞生長曲線

3 討 論

E2F-1是調節細胞周期進展的重要轉錄因子之一，通過調控下游多種靶基因的表達發揮作用，而其自身的活性變化則受到pRb的直接調節[4]。G1早期，精氨酸甲基化在細胞周期控制過程中負性地調節pRb的抑癌功能，部分是通過為Cdk復合磷酸化創造更好的底物和干擾pRb與E2F-1的相互作用，從而抑制細胞進入S期所需基因的轉錄。

E2F-1表達失調與多種腫瘤的發生具有相關性[5]，包括肺癌[6]、肝癌[7]、乳腺癌[8]、膀胱癌[9]和胰腺癌[10]。E2F-1在胃癌中也同樣具有表達異常的現象，并且慢病毒介導的E2F-1調控可抑制MGC-803胃癌細胞的增殖[11]。E2F-1在結腸癌中的也有較多的相關研究。E2F-1通過激活包括染色體DNA復制及其自身啟動子在內的多個基因來調節細胞周期的G1/S期轉變[12]。活性氧/磷酸肌醇3-激酶/AKT途徑激活，E2F-1表達上調，并介導結腸癌細胞增殖[13]。此外，在p53缺陷的人結腸癌細胞中，Mdm2抑制可通過激活Siva-1和PUMA的E2F-1和p73介導的蛋白表達而觸發細胞凋亡[14]。

盡管E2F-1在某些癌癥的發生和預后中已被證實發揮了作用，但是進一步生物信息學分析仍有待進一步研究。在前期研究中，我們發現E2F-1在結腸癌中的蛋白表達顯著增高，但是E2F-1表達水平與腫瘤的分期不存在關聯[2]。轉染E2F-1質粒后，E2F-1穩定過表達的LoVo結腸癌細胞繁殖收到抑制。從實驗結果的表面意義看，E2F-1在體外試驗中可能對結腸癌有抑癌作用。但是結合E2F-1在其他腫瘤中的矛盾表現，我們認為直接認定E2F-1為抑癌基因是有爭議的。因為E2F-1在細胞轉錄周期中是以細胞內“基因表達閥門”的身份存在的，其在腫瘤中的作用是透過其下游基因表達產物來實現的，沒有證據表面E2F-1表達產物直接參與細胞周期進展調節。例如：在腫瘤細胞中改變E2F-1的表達平衡，受E2F-1調控的多種促凋亡基因[15]活化，促使腫瘤細胞進入凋亡程序[16-17]。

因此，確定E2F-1介導的細胞周期進展、細胞凋亡和許多其他關鍵生理過程的主要機制，揭示E2F-1及其靶基因體系或網絡與不同類型的人類腫瘤的關系，可能揭示新的腫瘤治療策略。此外，許多研究證實了E2F-1和E2F家族其他成員與癌癥患者的臨床病理特征和生存結局之間的存在顯著相關性[18-19]，表明E2F-1有可能成為特定腫瘤的預測性腫瘤標記物[20]。