回陽生肌膏對人來源微血管內皮細胞的干預作用

周敏 賈湘隆 徐旭英

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer，DFU)是糖尿病微血管并發癥中最常見最嚴重的一種，多發生在糖尿病血管損傷致組織缺血、壞死、感染之后，發病后未及時規范治療往往會使病情進行性加重[1]，致殘致畸率極高，截肢(趾)術后5年病死率甚至高達50%～68%[2]。促進創面愈合是目前糖尿病足潰瘍臨床治療與科學研究的重要著眼點，但現有的治療方案往往起效慢且療效不佳，急需安全有效的治療手段促進創面愈合。創面修復的首要基礎是血管新生帶來的有效血氧供應，微血管內皮細胞通過多種方式參與血管新生及創面修復，改善糖尿病足潰瘍微血管內皮細胞功能有助于治療糖尿病足潰瘍。回陽生肌膏是首都醫科大學附屬北京中醫醫院的一種外用制劑，在臨床應用了數十年，已有研究對其促血管新生、促創面愈合的安全性及有效性進行了驗證[3]，本研究對2018年12月至2019年6月間北京中醫醫院瘡瘍血管外科住院部的大腿截肢患者進行了標本采集，按課題組前期研究報道的人來源原代微血管內皮細胞的分離培養[4]，通過進行細胞學體外實驗，探討回陽生肌膏對人來源微血管內皮細胞的影響，以期進一步明確回陽生肌膏促進微血管新生、促創面愈合的機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源

實驗標本均來自北京中醫醫院瘡瘍血管外科住院部2018年12月至2019年6月行大腿截肢患者，取大腿截肢后創面周圍皮膚和截除大腿近心端皮膚的真皮層。本實驗符合中華人民共和國國務院頒發的《醫療機構管理條例》，經過醫院倫理委員會論證并同意通過，標本采集前充分告知患者實驗方案并簽署知情同意書。

1.2 藥物

回陽生肌膏由首都醫科大學附屬北京中醫醫院瘡瘍血管外科提供，由肉桂、炮姜、人參、黃芪、當歸、白芥子、白蘞等藥物與凡士林調勻制成。龍珠軟膏由武漢馬應龍藥業集團股份有限公司提供，批號：110301。

1.3 人來源微血管內皮細胞分離與培養

采集標本后立即放入含雙抗的DMEM培養基中，分離原代微血管內皮細胞：PBS沖洗組織3次，于DMEM培養基中將組織修剪成 1 mm3大小，轉移至預濕培養皿，37℃、5% CO2細胞培養箱內靜置2小時，加入含20%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基繼續培養60小時，去除組織塊并更換培養基，純化細胞：滴3滴胰酶，10秒后吸棄舊培養基，加新培養基，每日1次換液，待細胞鋪滿單層后凍存或用于后續實驗。原代微血管內皮細胞培養：細胞生長培養基由 90%1640培養基、5%內皮細胞生長添加物(endothelial cell growth supplement，ECGS)、5%FBS配制，于37℃、5%CO2恒溫培養箱內培養。

1.4 實驗試劑與儀器

1640培養基(GIBCO，11875-085)，FBS(GIBCO，12664-025)，ECGS(ScienCell，1052)，RIPA總蛋白提取試劑盒(Sigma，R0278)，PMSF(Sigma，PMSF-RO)，蛋白酶抑制劑(Roche，11697498001)，BCA蛋白定量試劑盒(Sigma， BCA1)等；IgG抗體(H+L)、HRP(Jackson，111035003)，GAPDH抗體(天津銳爾康生物科技有限公司， REK0005)，MTT Cell Viability Assay(Thermo， V13154)，VEGFR2抗體(CST， 2479)。流式細胞儀(美國BD公司，Callibur II型)，倒置熒光顯微鏡(Nikon，T1000)，酶標儀(Therno scientific MultiSkan3)，電泳儀(Therno scientific Mini，Ge Tank)，轉膜儀(Therno scientific，Mini Blot Module)。

1.5 實驗分組及干預方法

實驗細胞均為原代或1～3代，共分為4組：將截除肢體的近心端皮膚標本所得微血管內皮細胞分為空白組，創面周圍皮膚標本所得微血管內皮細胞分別分為模型組、回陽生肌膏組、龍珠軟膏組。空白組、模型組均不予干預，回陽生肌膏組與龍珠軟膏組分別予最大無毒濃度Cmax1、Cmax2藥物，作用時間均為48小時。

1.6 MTT法篩選藥物最大無毒濃度

取空白組細胞，胰酶消化后制備為單細胞懸液，按細胞數1×104個、體積100 μL，接種于96孔板，共11個組，每組6個副孔，細胞貼壁后，吸棄舊培養基，隨機10個組分別加入1640培養基配制的不同濃度(200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL)回陽生肌膏、龍珠軟膏100 μL，對照組僅加100 μL 1640培養基，作用48小時后加MTT溶液，置于37℃培養箱4小時；吸棄溶液，10% SDS溶解細胞，570 nm下讀吸光值，按公式：細胞抑制率=[對照組光密度(optical density,OD)值-實驗組OD值]/對照組OD值×100%，計算細胞抑制率。運用GraphPad Prism 6.0計算出回陽生肌膏、龍珠軟膏作用于人來源微血管內皮細胞48小時的最大無毒濃度，即Cmax1、Cmax2。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

各組細胞按實驗設計分組處理48小時后，以胰酶消化，各組分別制備100 μL密度為1×106個/mL的單細胞懸液，每組加10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，室溫避光反應30分鐘后加400 μL PBS重懸細胞，上流式細胞儀檢測，收取細胞15000個/樣，不足15000個收取全部細胞；應用CellQuest軟件分析各組的細胞凋亡率。

1.8 ELISA檢測相關因子

取對數生長期細胞，各組細胞根據實驗分組分別處理48小時，按試劑盒操作說明書進行樣本提取，細胞上清樣品未做稀釋，檢測各組細胞基質金屬蛋白酶1(matrix metallopeptidase 1,MMP1)、MMP9、基質金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitors of matrix metalloproteinase 1，TIMP1)、基質金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP2)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達量。

1.9 細胞遷移實驗檢測遷移能力

在24孔中放置Transwell小室，根據實驗設計分組，上室加入對應分組的微血管內皮細胞，下室加入培養基及對應分組藥物，培養48小時后，PBS洗2次，加細胞固定劑500 μL/孔，置于室溫20分鐘；PBS洗滌2次，加0.4%的結晶紫500 μL/孔，室溫染色10分鐘；PBS洗滌10次，顯微鏡拍照同時對各組細胞的遷移細胞計數。

1.10 Western blot 法檢測相關蛋白表達

提取六孔板內細胞總蛋白，BCA法行蛋白定量，待檢測蛋白樣品上樣量為13 μg/孔，加入濃縮膠配 SDS-PAGE 膠，電泳：選擇MOPS緩沖體系，恒壓90 V，約20分鐘后恒壓120 V；轉膜，封閉，5%脫脂奶粉-TBS室溫輕搖膜30分鐘，分別加入VEGFR2抗體(1∶1000稀釋)和GAPDH抗體(1∶10000稀釋)，室溫孵育一抗10分鐘，4℃過夜。洗膜，室溫下孵育二抗40分鐘，洗膜后ECL法顯影曝光。應用Image J軟件分析WB檢測各條帶的灰度值，并按公式計算各組細胞的血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)蛋白相對表達量。

1.11 統計學處理

2 結果

2.1 藥物無毒濃度篩選結果

回陽生肌膏濃度為12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、龍珠軟膏濃度為12.5 μg/mL均能在一定程度上促進人來源內皮細胞增殖。考慮到微血管內皮細胞均取自糖尿病足潰瘍截肢患者，對應的高糖、缺血等病理狀態使空白組細胞的功能已有一定下降，因此選擇抑制率<10%情況下的最大濃度為后續試驗濃度為回陽生肌膏50 μg/mL、龍珠軟膏25 μg/mL，結果見表1。

2.2 回陽生肌膏對人糖尿病足創面內皮細胞抑制凋亡水平的影響

與空白組相比，模型組的總凋亡率顯著增高(P<0.05)；與模型組相比，回陽生肌膏組的總凋亡率降低(P<0.05)，龍珠軟膏組的總凋亡率也明顯降低(P<0.05)；回陽生肌膏組的凋亡率與龍珠軟膏組相比沒有統計學差異。結果見表2、圖1。

表1 藥物無毒濃度篩選結果

注：與空白組比較，aP<0.05。

2.3 回陽生肌膏對人來源微血管內皮細胞中MMP1、MMP9、TIMPI、TIMP2及VEGF表達的影響

與空白組比較，模型組MMP1、TIMP1含量均明顯增高(P<0.05)，MMP9含量顯著增高(P<0.05)，TIMP2含量明顯降低(P<0.05)，VEGF含量顯著降低(P<0.05)。與模型組相比，回陽生肌膏組與龍珠軟膏組的MMP9含量均明顯降低(P<0.05)、VEGF含量均明顯升高(P<0.05)，回陽生肌膏組的TIMP1水平出現降低(P<0.05)，龍珠軟膏組有降低趨勢，回陽生肌膏組與龍珠軟膏組的MMP1、TIMP2也有降低趨勢。結果見表3。

表2 各組人來源微血管內皮細胞凋亡水平比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

表3 各組人來源微血管內皮細胞基質金屬蛋白酶類、抑制劑類及VEGF含量水平比較

注： 與模型組比較，aP<0.05。

注：A空白組；B模型組；C回陽生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖1 各組人來源微血管內皮細胞流式凋亡圖

2.4 回陽生肌膏對人來源微血管內皮細胞遷移能力的影響

與空白組相比，模型組遷移細胞數顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，回陽生肌膏處理后遷移細胞數增多(P<0.05)；經龍珠軟膏處理后遷移細胞數明顯增多(P<0.05)；回陽生肌膏組的細胞遷移數與龍珠軟膏組相比沒有統計學差異(P>0.05)。結果見表4、圖2。

表4 各組人來源微血管內皮細胞遷移能力情況

注： 與模型組比較，aP<0.05。

2.5 回陽生肌膏對人糖尿病足創面內皮細胞中VEGFR2蛋白表達的影響

與空白組相比，模型組VEGFR2蛋白相對表達量呈現顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，回陽生肌膏組、龍珠軟膏組VEGFR2蛋白相對表達量均增高(P<0.05)，而回陽生肌膏組的VEGFR2水平與龍珠軟膏組相比沒有統計學差異(P>0.05)。結果見表5、圖3。

注：A空白組；B模型組；C回陽生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖2 各組人來源微血管內皮細胞遷移情況(×200)

表5 各組人來源微血管內皮細胞VEGFR2 蛋白的相對表達量

注： 與模型組比較，aP<0.05。

注：A空白組；B模型組；C回陽生肌膏組；D龍珠軟膏組。

圖3 Western blot測定各組人來源微血管細胞VEGFR2蛋白的表達

3 討論

截至2015年全球約4.15億成人罹患糖尿病，帶來的衛生支出總額約為6730億美元[5]，其中約有19%～34%的糖尿病患者在有生之年可能患糖尿病足潰瘍[5-6]，其中占大多數的慢性難愈性瘡面也被稱為慢性糖尿病足潰瘍，與中醫糖尿病足潰瘍陰證創面十分相似：病變部位深(多在血脈、筋骨)，創面膿質稀薄，肉芽蒼白或紫黯，創周皮色蒼白、紫黯[7]，往往遷延難愈。根據2017年的《中國糖尿病足診治指南》指出目前的治療方向主要是在內科治療基礎上促進創面愈合，常用手段主要是外科手術清創，也有自溶、化學、機械及生物等清創方法，除此之外還有自體皮膚移植、敷料、血管重建、生長因子、干細胞、基因等[8]治療方法。上述手段雖能在一定程度上延緩疾病進展，但往往速度緩慢、創面愈合效果不佳。在創面愈合中，血管新生帶來的有效血氧供應、營養物質與細胞因子的輸送是基礎保障[9]，微血管內皮細胞在目前已知血管新生的兩種實現方式中均扮演了不可或缺的角色，主要通過增殖遷移成管及合成分泌MMPs參與血管新生。創面早期MMPs 能降解血管基底膜，增加血管通透性幫助微血管內皮細胞遷移增殖成管以及發芽形成新生血管網[10]，但MMP1、MMP9的過度表達往往導致高蛋白水解并激發過度炎癥反應，限制細胞遷移增殖、阻礙上皮化，導致創面難以愈合[11]。TIMP類是MMP類的天然內源抑制劑，可由內皮細胞合成，與MMP特異性結合能不可逆地抑制MMP活性改善過度水解，但有研究發現過高的TIMP1會誘導細胞凋亡，過高的TIMP2會抑制內皮細胞遷移[12]，MMPs、TIMPs的過高表達均不利于血管新生和創面愈合。前面提到的MMPs在降解過程中還能通過刺激細胞因子的分泌參與血管新生，其中就主要包括生長因子VEGF[13]，VEGFR2與VEGF的結合激活可刺激血管內皮細胞增殖、遷移，增強血管通透性，除此之外還可影響下游PIK3/Akt通路促進血管新生[14]，這與課題組發現的回陽生肌膏能影響PIK3/Akt通路實現促血管新生的實驗結果相吻合[15]，VEGF/VEGFR2通路在誘導血管新生中也起著重要作用。

本研究發現回陽生肌膏與龍珠軟膏均能抑制人來源微血管內皮細胞在糖尿病足潰瘍狀態下的MMP9過度表達，對MMP1、TIMP2的表達也有下調趨勢，但回陽生肌膏對TIMP1含量的下調作用是龍珠軟膏所沒有的，除此之外，兩種藥物均能增加VEGF、VEGFR2的表達，龍珠軟膏據報道在治療糖尿病足潰瘍中具有促創面愈合，減輕局部疼痛的效果[16]，結合本科室臨床治療糖尿病足潰瘍陰證創面的療效，回陽生肌膏在促進糖尿病足潰瘍陰證創面愈合方面的療效可能高于龍珠軟膏。首都醫科大學附屬北京中醫醫院瘡瘍血管外科的回陽生肌膏在業內享有盛譽，具有促新生血管生成、促創面愈合作用[17]，由肉桂、炮姜、人參、鹿茸、白芥子、艾葉、黃芪、當歸、赤芍等藥物組成，其中黃芪性甘微溫，善益氣健脾，溫分肉，肥腠理，為外科家之圣藥，現代研究發現黃芪甲苷能提升血管內皮細胞活力[18]，另一方面還能通過PI3K/AKT通路保護內皮細胞[19]，人參所含人參皂苷能上調VEGFA、VEGFR2[20]，人參、黃芪共奏益氣之效；肉桂辛甘大熱，補火助陽，活血通經，能夠引導陽氣宣通血脈，肉桂中的肉桂醛的抗氧化作用能保護血管內皮細胞[21]，對體外成纖維細胞MMP1的過度表達也有下調作用，而鹿茸能上調VEGF表達[22]，肉桂、鹿茸與炮姜、艾葉有溫陽散寒之功，配伍當歸、赤芍養血活血，赤芍中赤芍總苷能降低MMP9、TIMP1表達[23-24]，以上諸藥配伍能“溫陽益氣，活血生肌”，使回陽生肌膏能通過調控MMPs與TIMPs、VEGF與VEGFR2表達，改善糖尿病足潰瘍陰證創面狀態下的微血管內皮細胞增殖、遷移功能，促進血管新生，實現創面愈合。

糖尿病足潰瘍陰證創面原本多“虛”多“瘀”，機體多脾腎陽虛、陰血不足，使機體氣化無能，表現為創面板結晦澀、肉芽紫黯蒼白、膿液稀薄，創面難以愈合，此類無血管新生、肉芽組織難以生長的創面應用回陽生肌膏后，膿液先由稀薄逐漸增多黃稠，而后再逐漸減少但仍淡黃，肉芽逐漸鮮明紅活，創周、創底逐漸向愈斂和，這一現象與本實驗發現的回陽生肌膏在體外對人來源微血管內皮細胞的影響有關，其機制可能是回陽生肌膏抑制了MMPs的過度表達改善了過度水解，對TIMP1的下調抑制了細胞凋亡，對TIMP2的下調增強了細胞遷移，從而促進血管新生實現了促創面愈合。另一方面，通過刺激VEGF/VEGFR2的表達，促進血管內皮細胞完成增殖遷移實現血管新生，并且影響PIK3/Akt通路改善氧化應激狀態，也是回陽生肌膏促進創面愈合的機制之一。筆者猜想應用回陽生肌膏后，基質金屬蛋白酶發揮的降解作用使壞死組織變得易于清除，創面膿液由原先的稀薄逐漸增多黃稠，實現“去腐”，為后續“生新”打下基礎，為防止過度降解對TIMP1、TIMP2的表達進行了調控以抑制MMP1、MMP9的活性，或許這是膿液增多后再逐漸減少的原因；而當MMP/TIMP的比值到達相對平穩時，繼續應用回陽生肌膏使MMP、TIMP的表達均有所下調，從而保證了血管內皮細胞的增殖與遷移；回陽生肌膏上調VEGF、VEGFR2的表達，膿液由原先的稀薄逐漸變為黃稠，血管內皮細胞遷移增殖促使血管新生網絡形成，提供的血氧及營養物質使肉芽紅活，創面愈合，這一“回陽以生肌，祛瘀以生新”過程正是回陽生肌膏理論依據“陽生陰長”的體現。

但在臨床實際中創面愈合始終處于一個動態的過程，本實驗中人來源微血管內皮細胞的標本采集與分離培養非常不易，數量有限，且試驗均采用原代或1～3代細胞，僅對回陽生肌膏體外干預人來源微血管內皮細胞48小時進行了檢測，若后期條件充分，考慮進行多時間點的檢測對比，結合臨床試驗，以期更全面地探究回陽生肌膏是如何動態地影響微血管內皮細胞來促進血管新生、創面愈合。