蒿秦化斑方對紫外線B誘導的HaCaT細胞光損傷的影響

馮丹 劉婷 李冠汝 孫麗蘊

環境污染導致大氣臭氧層的破壞日益加劇，紫外線(ultraviolet radiation，UV)輻射水平增加。紫外線輻射，特別是紫外線B(ultraviolet-B，UVB)290～320 nm直接作用于HaCaT細胞，通過誘導氧化應激、炎癥過程進而影響皮膚屏障功能，形成光損傷[1]。UVB輻射抑制HaCaT細胞內源性抗氧化劑超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)的活性并增加氧化終產物丙二醛(malondialdehyde,MDA)的產生[2]，UVB誘導的細胞損傷會激活炎性細胞因子，并能夠抑制細胞增殖和轉化生長因子β(transforming growth facor-β,TGF-β)通路調控的膠原蛋白的表達[3-4]，這是導致HaCaT細胞光損傷的重要內容。中醫藥治療光敏感性皮膚反應具有很好的療效，應用前景廣闊[5]。蒿秦化斑方在臨床中應用治療光敏感性皮膚病取得了較好的療效，由青蒿、秦艽、丹皮、赤芍等組成，其改善光損傷的機制尚未明確。本實驗通過建立UVB輻射誘導的HaCaT細胞光損傷體外模型，以蒿秦化斑方高、中、低劑量進行干預，觀察蒿秦化斑方對于UVB誘導的HaCaT細胞光損傷的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物

蒿秦化斑方湯劑，組方為青蒿30 g、生地黃15 g、水牛角15 g、秦艽10 g、牡丹皮15 g、赤芍15 g、防風15 g、生甘草6 g。由北京中醫醫院(供貨方：北京盛世龍藥業有限公司)提供。

1.2 主要器材與試劑

二氧化碳培養箱(MCO-15AC型，SANYO)，倒置顯微鏡(XDS-2B型，重慶光電)，超凈臺(SW-CJ-1D型，江蘇通凈)，分光光度計(NANODROP 2000，Therno scientific)，酶標儀(MultiSkan3，Therno scientific)，離心機(Centrifuge 5415D，Eppendorf)。

MEM α, Nucleosides(GIBCO，12571063)，EBSS(GIBCO，14155063)，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(GIBCO，12664-025)，胰酶(銳爾康,REK3012)，磷酸緩沖液(銳爾康，REK3005)，MTT(GIBCO，v13145)。

1.3 細胞及其培養

HaCaT細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心，在37℃,5% CO2, 95%濕度的二氧化碳培養箱中用含有10%FBS的1640培養基培養。待細胞密度增加至80%以上時，用0.25%胰酶消化，收集細胞。

1.4 細胞毒性的測定

HaCaT細胞按常規消化終止后用生長培養基調整細胞密度為1×105個/mL，100 μL/孔鋪于96孔細胞培養板內，24小時后，分別更換含不同劑量(12.1、6.05、3.03 mg/mL)的蒿秦化斑方培養基作用細胞24小時，棄掉細胞原培養基，加入100 μL的1640培養基和10 μL的MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide,噻唑藍)溶液，37℃反應4小時后棄掉MTT反應液，用10%的十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate,SDS)充分溶解細胞，570 nm下讀取吸光值，并計算細胞抑制率，選擇細胞抑制率小于10%的劑量作為最大無毒劑量。進行光密度(optical density,OD)值測定時，分光光度計上顯示的數值為每毫升溶液中的OD值，細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%。

在本研究中，默認同一批次的細胞之間沒有個體差異，為了保證實驗的可重復性，檢測細胞增殖情況設計為6孔重復，可有效降低誤差。

1.5 UVB照射與分組

將收集的細胞隨機分為5組，A組空白對照組：HaCaT細胞正常培養；B組UVB模型組：HaCaT細胞用300 mJ的UVB刺激15分鐘；C組中藥高劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細胞15分鐘后，加入對細胞抑制率小于10%的最大無毒劑量中藥(此劑量記作C)，作用24小時；D組中藥中劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細胞15分鐘后，加入C/2劑量中藥，作用24小時；E組中藥低劑量組：300 mJ的UVB刺激HaCaT細胞15分鐘后，加入C/4劑量中藥，作用24小時。

1.6 MTT法檢測細胞增殖

細胞模型結束后，棄掉細胞原培養基，加入100 μL的1640培養基和10 μL的MTT溶液，37℃反應4小時；棄掉MTT反應液，用10%SDS充分溶解細胞，490 nm下讀取OD值，并計算細胞抑制率，觀察各組對細胞細胞增殖的影響；細胞抑制率=(空白對照組OD值-實驗組OD值)/空白對照組OD值×100%

1.7 吸光度法測定SOD、CAT活性和MDA含量

各組細胞中加入RIPA裂解液，4℃反應30分鐘，離心后收集上清，進行定量后調整密度為2 mg/mL，根據制造商的說明書添加相應樣品，7℃反應1小時；酶標儀450 nm下檢測OD值，并計算SOD酶活性；測MDA含量時將標準曲線配制成2 mM 的MDA標準，分別加入0、2、4、6、8、10 μL溶于200 μL(ddH2O)，95℃、60分鐘，冰浴10分鐘后，酶標儀532 nm下檢測OD值，并計算MDA含量。測CAT活性時將樣本或陽性質控液加到每孔，調整總含量至78 μL，25℃，30分鐘后，加入10 μL的終止液，25℃孵育5分鐘，完全抑制樣本中的過氧化氫酶活性，作為HC，配制1 mM的H2O2，分別加入0、2、4、6、8、10 μL的MmH2O2，調整至90 μL，加入10 μL的終止液，每孔加入50 μL混合，酶標儀570 nm下檢測OD值并計算CAT活性。注：CAT活性以消耗等量的H2O2所需CAT的含量來測定，消耗等量的H2O2所需CAT含量越多說明CAT活性越低。

在本研究中，默認同一批次的細胞之間沒有個體差異，為了保證實驗的可重復性，每個樣本設計3個復孔。

1.8ELISA檢測細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM-1)、血管細胞間黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)、內皮細胞選擇素(endothelium-selectin,E-selectin)、白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)、TGF-β的含量。

各組細胞根據實驗分組分別處理，在450 nm下讀取吸光值， 以標準品劑量和吸光值繪制標準曲線(4-PL曲線擬合)， 通過標準曲線計算樣品中VCAM-1、 ICAM-1、 E-selectin、 IL-10、 TGF-β的含量。

在本研究中，默認同一批次的細胞之間沒有個體差異，為了保證實驗的可重復性，每個樣本設計3個復孔。

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 細胞毒性測定確定中藥最大無毒劑量

對細胞毒性的測定發現，1.25%中藥對細胞活性抑制率最低，對應的中藥濃度為12.1 mg/mL，因此可以確定中藥最大無毒劑量為12.1 mg/mL。見表1。

表1 不同濃度中藥對HaCaT細胞的抑制率

2.2 MTT法測定HaCaT細胞增殖

與空白對照組比較，UVB模型組細胞增殖能力降低(P<0.05)。與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高、中、低劑量組細胞增殖能力均增強(P<0.05)。見表2。

2.3 吸光度法檢測SOD、CAT、MDA含量

通過吸光度法測定各組細胞中SOD、CAT的活性以及各組細胞中MDA的含量。與空白對照組比較，UVB模型組SOD表達降低(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組SOD表達增多(P<0.05)。與空白對照組比較，UVB模型組分解1 μmol的H2O2所需的CAT量升高，CAT活性降低(P<0.01)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組分解1 μmol的H2O2所需CAT量減少，CAT活性增強(P<0.05)。與空白對照組比較，UVB模型組MDA含量增加(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組MDA含量降低(P<0.05)。見表3。

表2 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT 細胞增殖水平比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

2.4 ELISA法檢測ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10的含量

與空白對照組比較，UVB模型組ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、IL-10表達增多(P<0.05)，TGF-β表達降低(P<0.05)；與UVB模型組比較，蒿秦化斑方高劑量組ICAM-1表達增多(P<0.05)，蒿秦化斑方中、低劑量組ICAM-1表達無統計學差異(P>0.05)，蒿秦化斑方高、中、低劑量組VCAM-1、E-selectin、IL-10表達均增多(P<0.05)，TGF-β表達均降低(P<0.05)。見表4。

表3 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT細胞SOD、CAT、MDA含量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

表4 高中低濃度中藥組給藥后HaCaT細胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β、IL-10含量比較

注： 與空白對照組比較，aP<0.05；與UVB模型組比較，bP<0.05。

3 討論

UVB照射引起的光損傷，中醫稱之為“日曬瘡”，《外科啟玄》對日曬瘡有如下記載：“三伏炎天，勤苦之人，勞于任務，不惜身命，受酷日曬曝，先疼后破而成瘡著，非血氣所生也。”本病是由于強烈日光照射所致，以在曝曬處皮膚發生紅斑、水腫或水皰等損害為臨床表現，治療中以清熱除濕，涼血解毒為主[5]。 蒿秦化斑方具有清熱解毒、 涼血化斑之效。既往研究證明以青蒿、赤芍等清熱涼血解毒之品為主要組成成分的中藥抗光敏合劑可明顯改善皮膚光損傷[6]。因此，探討蒿秦化斑方對HaCaT細胞的光損傷影響及其可能作用機制有積極意義。

青蒿苦寒清熱，具有清熱涼血的功效。惠海英等[7]發現青蒿素可通過抑制炎性因子的產生對UVB所致光損傷起到保護作用。秦艽、水牛角、生地黃具有涼血消斑的功效。秦艽主要成分龍膽苦苷和獐牙菜苦苷具有抗炎作用[8]。生地黃有效成分梓醇具有抗氧化、抗炎作用[9]。丹皮、赤芍、防風共奏祛風涼血止癢之效。丹皮酚具有抗皮膚過敏、抗炎的作用[10]。赤芍中沒食子酸丙酯可通過增強SOD活性，降低MDA量發揮抗氧化作用[11]。防風辛溫發散，善于祛風止癢,防風多糖的抗氧化、抗炎特性得到了證實[12]。生甘草清熱解毒，調和諸藥，甘草總黃酮可通過降低MDA量，增強SOD活性，清除自由基以發揮到抗氧化的作用[13]。

在本研究中，通過建立HaCaT細胞UVB光損傷體外模型，檢測蒿秦化斑方對HaCaT細胞增殖、抗氧化防御能力標志物(SOD、CAT)、氧化產物MDA和炎癥因子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、TGF-β和IL-10)表達情況。本實驗中模型組細胞增殖能力降低，抗氧化酶活性降低，氧化產物增多，炎癥因子表達增多，提示成功建立HaCaT細胞光損傷模型。

UVB通過誘導減少內源性抗氧化劑(SOD、CAT)來促進氧化應激[14]。UVB照射引發的氧化應激是過量自由基降低SOD和CAT的活性，破壞自由基和抗氧化酶之間的平衡，脂質過氧化物MDA過度積累的過程，MDA的細胞毒活性能夠加劇氧化損傷[15]。SOD和CAT的活性、MDA含量是評價HaCaT細胞氧化損傷的重要指標。結果顯示在UVB照射后抗氧化劑SOD和CAT活性下降，而氧化產物MDA的含量增加，蒿秦化斑方高劑量組的SOD和CAT活性增強，MDA含量降低。中、低劑量組SOD和CAT活性、MDA含量沒有變化，提示高劑量蒿秦化斑方可以通過增強抗氧化酶(SOD、CAT)活性，降低氧化終產物MDA水平，改善氧化損傷。近期發現蟲草中分離的抗氧化物能夠通過增強SOD活性，降低MDA的含量，清除自由基，修復UVB誘導的氧化損傷[16]。二氫咖啡酸可以通過增強CAT的活性來減弱UVB照射造成的氧化損傷[17]，這與課題組的研究結果一致。

UVB輻射影響免疫和炎癥反應的過程[18]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin是皮膚炎癥和免疫刺激相關分子。據報道，系統性紅斑狼瘡、多形性日光疹皮膚中這些粘附分子表達上調[19]。燕華玲等[20]發現，多形性日光疹患者血清中ICAM-1和E-selectin表達顯著升高。VCAM-1作為炎性介質介導免疫反應的同時促使炎癥級聯放大[21]。UVB照射使IL-10產生增加，IL-10可抑制局部免疫反應，如接觸性超敏反應和延遲型超敏反應[22]。VCAM-1、ICAM-1、E-selectin和IL-10可以作為表征細胞免疫和炎癥反應的重要指標。結果顯示，UVB照射后VCAM-1、ICAM-1和E-selectin含量均升高，蒿秦化斑方高劑量組ICAM-1含量降低，蒿秦化斑方中、低劑量對ICAM-1的含量沒有影響。蒿秦化斑方高、中、低劑量組VCAM-1和E-selectin的含量均降低，研究說明高劑量蒿秦化斑方能夠抑制炎癥因子的表達，改善UVB誘導的HaCaT細胞的免疫和炎癥反應。

UVB誘導的氧化應激和炎癥，最終會導致皮膚屏障結構受損，形成難以愈合的傷口，細胞增殖和膠原蛋白的合成能夠修復皮膚屏障[23]。TGF-β具有組織修復作用，能夠調節膠原蛋白的穩態[24]，研究發現[25]，脂質介體雷索文D1通過增加TGF-β的表達對UVB照射引起的皮膚炎癥和氧化應激有明顯改善作用。研究顯示，UVB照射抑制了HaCaT細胞的增殖和TGF-β的表達，蒿秦化斑方高、中、低劑量組均能促進HaCaT細胞的增殖，促進TGF-β的產生。提示蒿秦化斑方可以通過細胞增殖和膠原蛋白的重組修復受損細胞。

綜上所述，高劑量蒿秦化斑方能夠改善UVB誘導的HaCaT細胞光損傷，其作用機制可能與以下三個方面有關：抑制氧化應激，下調炎癥因子的表達，修復細胞屏障功能。這三方面共同起到保護HaCaT細胞免受光損傷的作用。