金思維對擬散發性AD小鼠海馬PSD95和Shank1表達及學習記憶的影響

黃帥陽 吳藝瓊 鞏卓彥 王亞晗 瑪娜璐璐 劉珍洪 秦高鳳 王蓬文

阿爾茨海默病(alzheimer’s disease，AD)是以認知功能障礙和大腦萎縮為主要特征，且以突觸和神經元丟失、大量β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)沉積為主要的神經病理學病變[1]。在AD中、晚期神經病理學和形態學研究中發現大腦皮質和海馬許多區域都存在明顯的突觸缺失，但許多早期患者的突觸數量并沒有明顯減少，這些病人只表現出突觸結構改變和功能障礙[2-3]。突觸效能的改變可能發生在突觸喪失之前，而這種改變主要取決于突觸后谷氨酸受體數量的改變，同時伴隨著樹突棘和突觸后密度(post-synaptic density，PSD)區域的擴大或縮小[4]。PSD是指含有N-甲基-D-天冬氨酸受體和亞型谷氨酸受體、PSD蛋白如PSD95和Shank1等的電子致密增厚物[5]。突觸上谷氨酸受體的數量是決定突觸效能的主要因素之一，它可以估計突觸興奮性突觸后電流的大小。此外，PSD蛋白有助于解釋突觸的功能和區域結構以及它們在突觸可塑性中的可能作用[6]。

中醫藥復方具有多靶點的特點，并在治療SAD發揮了重要的作用。中醫藥復方金思維(以下簡稱“金思維”)是由人參、肉蓯蓉、石菖蒲、熟地黃、茯苓等藥物煎煮混合而成，具有補腎陽虛、豁痰開竅之效，金思維在臨床應用也顯示出顯著的療效。臨床研究取75例輕度認知損害患者(mild cognitive impairment，MCI)進行1年的隨訪，發現金思維觀察組簡易智能精神狀態檢查量表(mini-mental state examination，MMSE)的分值和詞語記憶積分與安慰組都存在明顯差異，表明金思維對老年MCI患者的記憶衰退具有良好的改善作用[7]。實驗研究也同時發現金思維提取物在APPV717I轉基因小鼠大腦淀粉樣斑塊形成前后均有激活鈣調蛋白依賴性激酶的表達和抑制鈣調蛋白依賴性蛋白磷酸酶2B表達的作用，可能在一定程度上緩解AD神經元突觸功能障礙[8]。然而，金思維在AD早期的具體治療靶點仍不清楚。這些發現促使我們研究金思維對AD突觸的作用機制。本研究采用雙側側腦室注射STZ為擬SAD小鼠模型，通過觀察海馬CA1區突觸相關蛋白PSD95和Shank1的表達，研究金思維對突觸的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡SPF級C57/BL6J雄性小鼠72只，體重22～25 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]，飼養于北京中醫藥大學東直門醫院屏障環境動物室[SYXK(京)2015-0001]，實驗期間動物自由飲水、攝食。本實驗經由北京中醫藥大學東直門醫院實驗動物倫理委員會批準實驗進行(倫理號:16-21)。

1.2 試劑及儀器

金思維免煎顆粒劑(本品各中藥比例人參為4.4%、蓯蓉17.3%、地黃17.3%、遠志13%、石菖蒲13%、姜黃13%、茯苓13%、丹參9%)由北京中醫藥大學東直門醫院制備[8]。鹽酸多奈哌齊由衛材(中國)藥業有限公司生產提供(批號140635)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(貨號S0130)由美國Sigma公司生產；一抗鼠抗小鼠β-actin抗體(貨號ab3280，Western blot 1∶1000)、兔抗小鼠PSD95抗體(貨號ab18258，Western blot 1∶500；免疫組化1∶1000)、兔抗小鼠Shank1抗體(貨號ab154224，Western blot 1∶1000,免疫組化1∶1000)均由Abcam公司提供。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒；5×蛋白上樣緩沖液(含DTT)；ECL超敏發光液；甘氨酸、十二烷基硫酸鈉(sod.dodecyl sulfate，SDS)、Tris base、無水甲醇等常規試劑購買自北京環亞泰克生物醫學技術有限公司。BCA法蛋白濃度定量試劑盒(貨號C-0018)，購于北京博奧森生物技術有取公司。兔二步法檢測試劑盒(貨號PV-9001)、DAB試劑盒由北京中杉金橋生物技術有限公司提供。儀器YLS-3TB跳臺記錄儀購自濟南益延科技發展有限公司；Mini-PROTEAN3電泳儀由美國BIORAD公司購買。

1.3 擬SAD小鼠模型制備和分組

擬SAD造模：隨機取C57/BL6J小鼠60只于第1和第3天雙側側腦室注射STZ(人工腦脊液配制，濃度6 mg/mL，3 mg/kg)。前囟后0.8 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處用牙科鉆顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自表面垂直進針2 mm，緩慢注入5 μL液體(注射時間為5分鐘)，注射完畢縫合切口[9]。

分組及給藥：將60只擬SAD模型小鼠適應性飼養一周后隨機分為5組：模型組(0.5%CMC)、多奈哌齊組(0.92 mg·kg-1·d-1)及金思維大、中、小劑量組(20、10、5 mg·kg-1·d-1)，每組12只。另取12只C57/BL6J小鼠于第1和第3天雙側側腦室注射等體積人工腦脊液，作為對照組(0.5%CMC)。所有小鼠連續灌胃3個月(0.1 mL/10 g)，1次/日。

1.4 擬SAD小鼠跳臺實驗檢測

末次灌胃結束后進行跳臺檢測。YLS-3TB跳臺記錄儀是被黑色塑料板分隔為5個方形空間的密閉長方體，每個方形空間中心是一個絕緣性高站臺，其黑箱底部鋪以可通電流的銅柵。第1天為訓練期，先將小鼠放入跳臺箱內適應3分鐘，接通底部銅柵交流電訓練5分鐘。第2天為試驗期，將小鼠再次放在平臺上，底部銅柵通交流電后，記錄5分鐘內小鼠第一次從平臺跳下所需的時間(即跳臺潛伏期)，并以時間單位秒(s)記錄，以此反映小鼠記憶獲得和保持能力。

1.5 擬SAD小鼠海馬PSD95和Shank1的Western blot檢測

每組各取6只小鼠麻醉后斷頭處死，然后立即置于冰浴上剝離小鼠大腦海馬組織，用生理鹽水沖洗凈后置于-180℃液氮罐中儲存備用，取腦組織進行海馬蛋白提取和BCA濃度測定。將海馬置于EP管中，加入RIPA組織/細胞裂解液，利用超聲粉碎機勻漿之后進行離心，獲得上清液。配置BCA工作液，對海馬組織進行濃度測定。按照制備SDS-PAGE膠、蛋白質加樣、電泳、轉膜、封閉、抗原抗體反應、顯色、曝光的步驟進行操作。最后通過Image J軟件對Western-blot所測蛋白條帶進行分析，用內參β-actin的灰度值作為比較，對結果進行分析并計算相對百分數，即(ID/內參ID)×100%。

1.6 擬SAD小鼠海馬CA1區PSD95和Shank1免疫組化檢測

每組另外取6只小鼠灌注取材作免疫組織化學染色，將固定的腦組織進行冠狀面取材、脫水、石蠟包埋、切片[5]。將小鼠海馬CA1區制成厚度約為4 μm的連續冠狀切片，然后對切片進行脫蠟、水化、抗原修復、兔二步法試劑檢測、封閉、抗體反應、DAB顯色、脫水透明、封片。最后在20倍物鏡下選擇3個視野觀察海馬CA1區陽性細胞數取平均值并與其他組陽性細胞數作比較分析。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠跳臺測試結果

在行為學跳臺測試中，模型組小鼠潛伏期時間與對照組相比顯著降低(P<0.01)，模型組小鼠記憶獲得能力較差，對第1天的訓練不能進行很好的記憶保持。多奈哌齊組和金思維小劑量組與模型組相比潛伏期時間顯著增長(P<0.01)，金思維大、中劑量組對比模型組潛伏期時間也有不同程度的增長(P<0.05)，這表明金思維干預都不同程度的增強了小鼠的記憶獲得能力，結果見表1。

表1 各組小鼠跳臺潛伏期結果比較

注： 與對照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.2 各組小鼠海馬PSD95和Shank1的Western blot檢測

與對照組相比，模型組小鼠海馬PSD95蛋白(P<0.01)和Shank1(P<0.05)蛋白表達條帶明顯變細且顏色變淺；多奈哌齊組與模型組相比，PSD95和Shank1蛋白表達條帶增寬，顏色加深(P<0.05)；PSD95檢測中金思維大、中劑量組較于模型組蛋白條帶稍增粗，顏色略深；Shank1條帶檢測中金思維中劑量組(P<0.05)、小劑量組(P<0.01)相較于模型組都有不同程度的增粗和加深。結果見表2、圖1。

表2 各組小鼠海馬PSD95和Shank1 蛋白表達比較只)

注： 與對照組相比，aP<0.05，bP<0.01；與模型組相比，cP<0.05，dP<0.01。

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖1 各組小鼠海馬PSD95和Shank1蛋白免疫印跡檢測

2.3 各組小鼠海馬CA1區PSD95和Shank1免疫組化檢測

小鼠海馬CA1區PSD95和Shank1陽性細胞棕黃色，細胞形狀多為橢圓形或圓形。模型組與對照組相比，海馬CA1區PSD95和Shank1的陽性細胞數均顯著減少、染色變淺(P<0.01)；與模型組相比，多奈哌齊組、金思維大劑量組和中劑量組的PSD95陽性細胞數都略增多(P<0.05)；與模型組相比，多奈哌齊組中Shank1陽性細胞數明顯增多(P<0.01)，金思維中、小劑量組的Shank1陽性細胞數略增多(P<0.05)，結果見表3，圖2、3。

表3 各組小鼠海馬CA1區PSD95和Shank1 陽性細胞數比較只)

注：與對照組相比，aP<0.01；與模型組相比，bP<0.05，cP<0.01。

3 討論

在AD的研究中，突觸被認為是最早的病理部位，突觸的變化和丟失是認知損傷重要的病理相關[10]。早期記憶喪失源于神經元死亡前的突觸功能衰竭，而突觸功能衰竭源于Aβ寡聚體(Aβ-derived diffusible ligands，ADDLs)而非神經元纖維纏結[11]。PSD是興奮性突觸樹突狀棘內的一個局部密集區域，由突觸可塑性相關的受體、激酶、結構蛋白和信號分子組成。PSD95是神經發育過程中參與谷氨酸能傳遞、突觸可塑性和樹突狀形態形成的重要成分。因此，PSD95在發育過程中的功能障礙可能會改變樹突棘上的突觸可塑性發生，而這些突觸可塑性的發生會導致與神經疾病相關的突觸畸形改變[12]。實驗數據表明這些ADDLs與神經元表面結合，且90%的結合位點與突觸標記物PSD95共定位；同時Aβ42的神經毒性可以誘發PSD95蛋白表達的下調，進而影響突觸可塑性，并導致大鼠的學習和記憶能力受損[13]。

Shank蛋白是PSD中谷氨酸受體的組織者，由Shank1、Shank2和Shank3三個基因編碼[14]，在神經發育和認知中起重要作用。其中Shank1在正常突觸結構和信號傳導中起著重要作用，包括突觸長時程增強(long-term potentiation，LTP)和長時程抑制(long-term depression，LTD)作用，這些過程被認為是學習和記憶形成的基礎[15-16]。研究發現Shank1敲除小鼠表現出樹突棘密度降低，樹突棘表型不成熟，在行為學測試中表現認知障礙[17]。這些研究都表明適當調控Shank1對于正常的突觸結構和認知至關重要。在AD中，突觸損傷的過程可能始于突觸相關蛋白的失調，如PSD95和Shank1[18]。然而，海馬體作為大腦重要區域之一，被一致認為參與調節學習和記憶功能，尚不確定Shank1在海馬體中的發育表達。本研究的目的是在AD早期檢測海馬CA1中Shank1的表達，以確定正常海馬發育與Shank1表達的關系。

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖2 各組小鼠海馬CA1區PSD95表達對比(免疫組化×20，標尺=50μm)

注：a對照組；b模型組；c多奈哌齊組；d金思維大劑量組；e金思維中劑量組；f金思維小劑量組

圖3 各組小鼠海馬CA1區Shank1表達對比(免疫組化×20，標尺=50μm)

STZ是一種亞硝基脲衍生物，在中樞可以阻斷胰島素受體引起腦源性胰島素抵抗，從而使胰島素信號傳導障礙和氧化代謝下降[19]。已證實小劑量STZ雙側側腦室隔日注射可以引起小鼠腦內持久的葡萄糖代謝紊亂和能量生成障礙，進一步引起高爾基體和內質網功能障礙，導致腦內Aβ表達增加，Aβ聚集成ADDLs，并可釋放和結合到特殊位點，影響突觸的結構和功能蛋白的表達，影響信號轉導和突觸可塑性，造成記憶丟失，常被作為擬SAD的動物模型應用[20]。

前期課題組研究發現用金思維干預治療APP/PS1雙轉基因小鼠，可以明顯改善AD小鼠在行為學水迷宮和跳臺檢測中的表現，電鏡下觀察AD小鼠海馬的病理切片也發現金思維干預治療組與模型組有顯著差異，神經元、突觸形態學結構較模型組都有明顯改善[21]。在東莨菪堿致記憶障礙小鼠模型中，金思維可以提高模型組小鼠在水迷宮中的定向航行和空間探索能力，可使模型組小鼠腦內乙酰膽堿含量升高、乙酰膽堿酯酶活性下降和乙酰膽堿轉移酶活性升高[22]。為了進一步評價金思維的作用和探究金思維對AD小鼠海馬突觸保護作用機制，課題組使用STZ雙側側腦室隔日注射擬SAD模型進行了本次實驗研究。結果發現模型組小鼠海馬PSD95和Shank1表達均降低，藥物組金思維的干預都不同程度的增加了PSD95和Shank1蛋白的表達。免疫組化和Western-blot結果顯示一致，金思維給藥組較于模型組小鼠海馬CA1區的PSD95和Shank1的陽性細胞表達數量明顯增加且染色深度不同程度的加深。這些結果表明金思維提高了SAD記憶獲得能力，且可能是通過調節海馬突觸相關蛋白PSD95和Shank1來改善突觸效能，從而發揮保護AD作用。