林下參炭疽病病原的分離與鑒定

崔麗麗，馮志偉，宋明海，丁憲文

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林 長春 130112；2.撫松縣參王植保有限責任公司，吉林 白山 134504）

人參自古被譽為“百草之王”，是扶正固本極品，味甘微苦，具有大補元氣、養血益血、寧心安神、生津止渴和清肺平喘等功效，含多種皂甙和多糖、揮發油、氨基酸和多肽等成分。隨著人參加工技術發展，人參所含淀粉向蔗糖轉化，甜度增加淡化了人參的“苦”味[1]，大大改善了人參的口感，除在醫療保健、美容護膚領域外，在食品飲料等領域的應用越來越廣泛。野生人參、園參與林下參是同科同屬植物，即五加科（Araliceae）人參屬（Panax）多年生草本植物人參（Panax ginseng C.A.Meyer.），在種子上沒有天壤之別，只不過存在栽培條件和生長環境上的差異[2]。林下參是仿照野生人參生長條件，將人參種子撒播到林地，一般至少15 年后進行采挖。林下參自然生長周期長，具備一定的野山參外部形態和內在品質特征，2015 版《中國藥典》正式將林下護育人參定義為“林下山參”[3]。調查分析發現長白山林下參發生的病害主要有人參猝倒病（Pythium debaryanum）、人參立枯病（Rhizoctonia solani）、人參黑斑?。ˋlternaria panax）、人參灰霉病（Botorytis cinerea）、人參根腐?。‵usarium solani）、人參疫病（Phytophthora cactorum）、人參銹腐?。–ylindrocarpon spp.）和人參菌核?。⊿clerotinia schinseng）[2，4]。各地區常發病害種類和發病程度有所不同，苗期病害以低溫病害人參猝倒病和人參立枯病為主，而莖葉部病害以人參黑斑病、人參灰霉病和人參疫病發病較嚴重，根部主要以人參菌核病、人參根腐病和人參銹腐病危害嚴重。人參炭疽病主要為害人參葉、莖和果實[5]，為害不重，一般發生在園參上，凡是種植地區均有發生?！吨袊藚ⅰ分杏涊d人參炭疽病最早發現于日本，后相繼在中國、朝鮮和俄羅斯遠東地區均有發生；在日本和朝鮮常造成50%的損失，在俄羅斯遠東地區的人參幼苗上曾發病100%[6]。我國尚未見炭疽病在林下參中發病的相關報道。2018 年7 月3 日，我們團隊在吉林省白山市撫松縣松江河鎮林下參種植基地發現類似人參炭疽病癥狀的葉部病害大面積發生，發病面積為0.5 hm2。大部分發病林下參葉片壞死，造成近30% 的損失。采集病害樣本進行病原鑒定和致病性測定，確定為人參炭疽病，這也是首次發現林下參發生人參炭疽病。

1 材料與方法

1.1 病害癥狀描述

根據田間發病和人工接種發病植株進行癥狀描述。

1.2 病原菌分離、純化

取病害典型部位人參葉片采用組織分離方法獲得病原物。用刀片切取病健交界處的病葉若干塊，大小為2 mm 2 mm，放在0.1%升汞中消毒0.5 min。然后用無菌水沖洗3 次，晾干，置于平板培養基上，每皿4 塊，然后置于25 ℃恒溫培養箱下培養3～5 d。

將分離培養得到的菌種單菌落菌絲挑到平板上進行純化培養，48 h 后，用滅菌的接種鏟挑取菌落菌絲移至PDA 斜面培養基上，即分離獲得純菌株。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 病原菌形態學鑒定 挑取待測菌株菌落外緣菌絲于培養基上培養24 h，每個菌落接種2 皿，在培養皿菌落外緣用打孔器打取直徑為7～9 mm 的菌絲塊，用滅菌的鑷子移入平板中央，菌絲面朝上，25 ℃恒溫培養箱培養，每個菌株3 次重復，每12 h觀察1 次菌落，并在顯微鏡下觀察菌絲的特征，同時觀察菌絲生長方式、菌落茂盛程度、產孢情況及有無色素或液體產出。

1.3.2 病原菌分子鑒定 挑取待測菌株菌絲于PDA平板上，25 ℃培養3～4 d 后，對培養基表面菌絲及分生孢子進行刮取備用。采用易潤華等[7]的方法，用DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取病原真菌基因組DNA。分析區段為ITS rDNA 序列和actin基因序列。rDNA ITS 區和actin 基因的擴增及測序采用文獻方法[8-9]：以真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAG GTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和actin基因通用引物ACT-512F（5'-ATGTGC AAGGCCGGTTTCGC-3'）/ACT-783R（5'-TACGAGTC CTTCTGGCCCAT-3'），PCR擴增菌株的rDNA ITS 和actin 序列。反應體系：10 Ex Buffer 5L，2.5 mmol/L dNTP 1L，10mol/L Primer ITS1 2L，10mol/L ITS54 2L，Genomic DNA 20 ng，5 U/L Ex Taq 0.5L；ddH2O 補足至50L。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃復性80 s，35 個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增PCR 產物，回收目標DNA 片段，PCR 產物純化和測序委托中國工業微生物菌種保藏管理中心完成，進行分子生物學鑒定。

1.3.3 致病性鑒定 按照柯赫氏法則，從林下參發病葉片上分離純化到的病原菌，采用傷口接種法回接到健康葉片，觀察是否得到相同的癥狀。具體方法：將保存的待測菌株挑取邊緣菌絲于平板上活化，25 ℃下培養3 d 后備用。用無菌水將健康的人參葉片噴施干凈，用滅菌刀片輕輕刮傷接種部位，然后挑取菌絲片貼在接種部位，最后用保鮮膜纏繞保濕培養。對照均以無菌水浸濕的脫脂棉接種在刮傷的健康人參葉片處，每個處理3 次重復。經過前期顯微鏡鏡檢和后期菌株分離純化及初步形態學鑒定，初步確定此病害為炭疽病，因炭疽菌的發生條件是低溫高濕，所以致病性測定過程中要保證其低溫高濕的環境條件，后觀察其發病情況。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

病菌初浸染時，葉片正面有黃白色針尖大小斑點，近圓形，邊緣有明顯且較大的黃暈圈。后斑點逐漸擴大為圓形、近圓形或不規則形，斑點邊緣變褐色，中間黃白色，并變薄透明狀，濕度加大時，病斑變黑褐色，黃暈圈變黃白色，后期病斑易穿孔，多個病斑連片時，穿孔造成破爛葉。莖稈受浸染，病部褪綠，變黃白色，病斑中心凹陷，黃白色，病斑邊緣黃褐色，病斑周圍有褪綠暈圈（圖1）。

圖1 林下參葉片病害癥狀Fig.1 Leaf disease symptoms of wild ginseng

2.2 病原菌形態學鑒定

從壞死林下參的葉片上取樣鏡檢觀察，可見到大量分生孢子和分生孢子盤。分生孢子盤盤狀或墊狀，生于寄主植物表皮下，分散或合生，成熟后不規則開裂，有時有剛毛。剛毛褐色至暗褐色，有隔膜，向頂端漸尖。分生孢子梗通常無色，基部分枝，表面光滑。產孢細胞圓柱形，無色，內壁牙生瓶體式產孢。分生孢子短圓柱形至新月形，無色，單孢，壁薄，表面光滑，有時含有油球。附著孢褐色，邊緣整齊或瓣狀，有時可形成復雜的結構（圖2）。

在PDA 培養基上，25 ℃培養7 d，菌落直徑55～57 mm，中央褐色，周圍灰黃色，表面平坦，質地絲絨狀；反面淺黃色，無滲出液產生，無可溶性色素產生。純菌株顯微鏡下分生孢子盤褐色，老后有剛毛，分生孢子梗簇生，有大量類附孢結構產生，分生孢子圓柱形，一端鈍圓，一端較尖，大小18～23m 3.7～4.5m。根據菌落形態特征和分生孢子形態等[10]，鑒定該菌株為人參炭疽病病菌人參刺盤孢Colletotrichumpanacicola（圖3）。

圖2 林下參病葉病原菌形態Fig.2 Pathogen morphology of wild ginseng diseased leaf

圖3 培養后林下參炭疽病菌落形態和分生孢子Fig.3 Colony morphology and conidia of wild ginseng anthracnose after culture

2.3 病原菌ITS 區和actin 基因序列測定結果

PCR 擴增后進行序列測定，獲得ITS r DNA 序列和acti n 基因序列片段（圖4）。將所得的序列與Gen-Bank 數據庫中己有的序列進行Blast 相似性比較，結果發現與C.panacicola 的同源相似性均為100%（圖5）。ITS rDNA 序列：

圖4 ITS rDNA 序列和 基因序列片段Fig.4 ITS rDNA and gene sequence fragment

圖5 同源性分析Fig.5 Homology analysis

選取GenBank 登錄的Colletotrichum 屬內不同種的ITS rDNA-actin 基因串聯序列系統發育樹，系統發育學分析采用MEGA 5.0 軟件，鄰位連接法顯示所測菌株與相關種的ITS rDNA-actin 基因串聯序列系統發育樹，進行1 000 次的相似度重復計算，結果表明，測試菌株Jrg6 ③與人參炭疽菌C.panacicola 聚為一類，與其遺傳距離最近（圖6）。由此也進一步證實了形態學鑒定結果的準確。

2.4 致病性測定

選取健康的林下參植株葉片，將分離得到的菌株，采用傷口接種法進行接種，同時以健康人參葉片接種無菌水浸泡脫脂棉為對照，3 d 后接種人參葉片陸續開始發病，說明其致病性較強。從以上接種的發病葉部再分離的病菌與原接種菌株相同，因此能夠證實原接種菌株為致病菌（圖7）。

圖6 病原菌rDNA ITS 區系統進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of pathogen rDNA ITS region

圖7 林下參葉片上病原菌的致病性測定Fig.7 Pathogenicity determination of pathogenic bacteria of wild ginseng leaves

3 結論

從林下參病葉上分離獲得病原菌，經病原菌形態學鑒定、分子生物學鑒定和致病性測定，確認此病菌為人參刺盤孢C.panacicola，提示人參炭疽病在林下參上已有發生。病菌是以分生孢子和菌絲體在病葉組織內越冬，成為下一年的病害侵染源。病害在多雨、氣溫偏低的條件下更容易流行發生，林下參的種植護育要引起重視、加強預防，一旦發現病葉應及時摘除，減少越冬菌源。

鳴謝 感謝在采集標本過程中徐懷志同志的大力協助。