驢源羅伊氏乳桿菌的安全性評價

王卓，馮培祥，李光玉，劉曉穎，郭肖蘭，司華哲，姜桂苗，趙付偉，劉晗璐※

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林省特種經濟動物分子生物學省部共建國家重點實驗室，吉林 長春 130112；2.聊城大學驢產業科技協同創新中心，山東 聊城 252000；3．國家膠類中藥工程技術研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

關鍵字：驢源；羅伊氏乳桿菌；安全性

益生菌是指能夠產生抗菌物質或者能夠產生對生物體有益的活性物質，對于動物健康或提高免疫力有積極作用[1-2]。在無抗飼養的大環境下，畜禽飼用益生菌產品亟待開發。乳酸菌是益生菌中應用最廣泛的菌種之一[3-4]。益生菌株發揮益生作用時存在來源特異性、種屬特異性和菌株差異性[5]，為開發驢源益生菌制劑，本研究從東阿黑毛驢腸道中分離、篩選出一株羅伊氏乳桿菌L2-2。益生菌作為一類活性微生物，必須滿足其不具有致病性的前提，特別針對新型的益生菌菌株，安全性評價是一項很重要的基礎工作[6-7]。小鼠是藥物篩選性試驗、毒性試驗和安全評價試驗最常用的動物，避免了動物數量需求大、宰殺取樣困難的限制[8]。本研究以小鼠為研究對象，對驢源羅伊氏乳桿菌L2-2進行小鼠安全性檢驗，測量小鼠體重和采食量，檢測臟器指數、血液學指標、細菌易位情況，以期判斷其作為益生菌的可行性，為開發驢源益生菌制劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

羅伊氏乳桿菌（L2-2），由本研究從健康驢腸道中分離并鑒定。取活化的受試菌株接種到MRS液體培養基中，37 ℃培養18 h，以5 000 r/min，4 ℃離心10 min，用生理鹽水調整有效活菌數為5 1010CFU/mL。

1.2 試驗動物

健康ICR 小鼠，體重18～22 g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供，動物質量合格證號為SCXK-（吉）2016-0003。

1.3 急性經口毒性試驗

參照《食品安全國家標準急性經口毒性試驗》（GB 15193.3-2014）[9]要求進行試驗。隨機選取雄性小鼠24 只，分為2 組，每組各12 只，分別為對照組和羅伊氏乳桿菌組，其中，對照組小鼠灌喂生理鹽水，羅伊氏乳桿菌組小鼠灌喂劑量為1 1010CFU/mL 的菌液，每天9：00 經口灌胃1 次，劑量為0.2 mL/只，連續灌胃7 d。每天觀察并記錄小鼠的行為、中毒表現、腹瀉情況和死亡情況。每隔2 d 稱體重，飼喂7 d 稱重后摘眼球采血1 mL，每組4 個血液樣本置于EDTA 抗凝管內，用于血液細胞分析；另外8 個血液樣本置于促凝固管中，用于血液生化指標分析。小鼠脫頸椎處死后進行解剖檢查，稱重肝臟、脾臟、腎臟和胸腺，按照以下公式計算其臟器指數：臟器指數=臟器質量（mg）/體質量（g）100。

1.4 細菌易位試驗

經口毒性試驗結束后，無菌操作下隨機取試驗組3 只小鼠的肝臟、脾臟、腎臟，加入適量的無菌生理鹽水制成組織勻漿液，涂布于MRS 固體培養基，另取組織勻漿中加入菌液后涂布于MRS 固體培養基作為陽性對照，以生理鹽水代替組織勻漿涂布于MRS 固體培養基作為陰性對照，在37℃培養48h，觀察菌落生成情況。

1.5 小鼠血液細胞分析

血液樣本置于EDTA 抗凝管中后，立即進行紅細胞計數、白細胞計數及分類、血紅蛋白濃度和血小板計數等血液學指標的測定。

1.6 小鼠血液生化指標測定

將血液樣本置于促凝固管中，以4 ℃，3 500 r/min條件下離心5 min，檢測血清中的白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、血高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）和乳酸脫氫酶（LDH）含量，測定用試劑盒購自中生北控有限公司。球蛋白（GLOB）為TP和ALB 的差值。

1.7 數據統計與分析

使用SPSS 21.0 統計軟件進行數據處理，并采用獨立樣本t 檢驗對試驗數據進行統計分析及顯著性檢驗。試驗數據以“平均數±標準差”表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 對小鼠體重和采食量的影響

小鼠灌服高劑量羅伊氏乳桿菌后采食、糞便均無異常，體重持續增長，體重和采食量見表1，未出現死亡現象；驢源羅伊氏乳桿菌L2-2 小鼠經口灌服后，未對小鼠采食和生長性能產生異常影響。

表1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠體重及采食量的影響Table 1 Effects of large dos the body weight and feed intake of mice

表1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠體重及采食量的影響Table 1 Effects of large dos the body weight and feed intake of mice

組別Group初始體重（g）Initial body weight不同天數體重（g）Body weight on different days 體增重（g）Body weight gain日采食量（g）Daily feed intake 3 d 5 d 7 d對照組Control group 21.42±1.12 25.14±1.27 26.89±1.44 28.78±1.71 7.36±1.30 3.97±0.22羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 21.22±0.94 24.75±0.90 26.69±0.99 28.55±1.59 7.57±1.25 4.06±0.02 P 值P-value 0.631 0.381 0.696 0.724 0.679 0.652

2.2 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠臟器指數的影響

由表2 可知，灌服羅伊氏乳桿菌L2-2 后，小鼠心、肝、脾、肺、腎和腸道均未出現病變，小鼠胸腺指數明顯增加（P ＜0.05），肝臟指數、脾臟指數和腎臟指數均無顯著差異。

表2 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠臟器指數的影響Table 2 Effects of large index of mice

表2 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠臟器指數的影響Table 2 Effects of large index of mice

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences（P ＜0.05）.

組別Group 肝臟指數Liver index脾臟指數Spleen index腎臟指數Kidney index胸腺指數Thymus index對照組 Control group 6.73±0.48 0.55±0.08 1.62±0.15 0.248±0.043 b羅伊氏乳桿菌組 Lactobacillus reuteri group 6.88±0.79 0.62±0.12 1.67±0.19 0.308±0.063 a P 值 P-value 0.590 0.112 0.475 0.012

2.3 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠細菌易位情況

如圖1 所示，灌服羅伊氏乳桿菌L2-2 后小鼠肝臟、脾臟及腎臟未見有菌落長出。結果表明，灌服高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 后小鼠肝臟和腎臟、脾臟未發生細菌易位現象。

圖1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠細菌易位情況Fig.1 Bacterial translocation of large dos

2.4 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠血液生化指標的影響

由表3 可知，高劑量羅伊氏乳桿菌可以顯著提高小鼠血清中GLOB 含量（P ＜0.05），同時可以極顯著降低血清中TG 含量（P＜0.01），對葡萄糖、膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of large dosees of mice

表3 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of large dosees of mice

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（P ＜0.01）。Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant differences（P ＜0.05）;Different capital letters in the same column indicated extremely significant differences（P ＜0.01）.

組別Group ALB（g/L）TP（g/L）GLOB（g/L）Glu（mmol/L）LDH（U/L）ALP（U/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）CHO（mmol/L）HDL（mmol/L）對照組Control group 20.85±1.21 44.22±1.70 23.37±1.23 b 8.06±0.55 879.66±117.41 135.06±17.85 1.25±0.13 A 0.45±0.03 3.16±0.18 1.87±0.14羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 20.19±0.74 46.53±2.22 26.34±1.75 a 8.50±0.73 845.13±83.82 145.84±27.88 0.82±0.12 B 0.46±0.06 3.20±0.48 1.97±0.25 P 值P-value 0.331 0.102 0.015 0.347 0.607 0.487 0.001 0.902 0.865 0.458

2.5 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠血液學指標的影響

由表4 可知，試驗組小鼠血液紅細胞、白細胞數量、血紅蛋白濃度和血小板數量等血液學指標與對照組相比均差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血液學指標的影響Table 4 Effects of large dosehematological indices of mice

表4 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血液學指標的影響Table 4 Effects of large dosehematological indices of mice

組別Group白細胞數目（ 109/L）Number of WBC淋巴細胞數目（ 109/L）Number of lymphocytes單核細胞數目（ 109/L）Number of mononuclear cells中性粒細胞數目（ 109/L）Number of neutrophils淋巴細胞百分比（%）Lymphocyte percentage單核細胞百分比（%）Percentage of mononu-clear cells中性粒細胞百分比（%）Percentage of neutrophils紅細胞數目（ 1012/L）Number of red blood cells血紅蛋白含量（g/L）Hemoglobin content血小板數目（ 109/L）Number of platelet對照組Control group 7.03±1.68 5.40±1.63 0.20±0.09 1.48±0.26 75.52±5.28 3.13±1.30 21.35±4.17 7.62±0.70 144.17±8.84 1 382.00±248.34羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 6.95±0.79 5.40±0.68 0.13±0.05 1.42±0.33 77.42±4.12 2.08±0.25 20.50±4.05 7.05±0.85 133.00±6.08 1 643.50±357.98 P 值P-value 0.930 1.000 0.170 0.764 0.561 0.153 0.758 0.276 0.094 0.206

3 討論與結論

腸道菌群與動物機體健康息息相關。有益菌群不僅可以促進機體免疫應答，而且能代謝產生多種消化酶從而促進營養物質吸收，抑制腸道有害菌群，以維持腸道菌群平衡，發揮腸道生物屏障作用[10]。宿主動物的胃腸道內微生態系統處于一個動態平衡狀態[11]。在正常情況下，胃腸道菌群中共生菌之間相互作用，為宿主胃腸道提供一定的營養及屏障功能，維持胃腸道的穩態[12]。當外源攝入高劑量微生物后，胃腸道內微生物之間會出現相互依賴，相互促進和相互制約，機制極其復雜，其安全性評價是一個必不可少的環節。

正常時各臟器與體重的比值稱為臟體比或臟器指數，臟器指數比較穩定，當臟器充血、水腫、增生肥大或者臟器萎縮及其他退行性改變等則會引起臟器指數的變化，是毒理試驗常用的指標。本研究結果顯示，羅伊氏乳桿菌對小鼠肝臟指數、脾臟指數和腎臟指數均無明顯影響，但可以顯著提高胸腺指數。胸腺是小鼠體內重要的免疫器官，胸腺指數主要反映機體的非特異免疫能力。胸腺也是機體的一個分泌器官，髓質上皮中的Ⅵ型上皮細胞具有合成、分泌功能，可以分泌胸腺素及胸腺生成素。胸腺素和胸腺生成素分泌能夠活化T淋巴細胞參與機體的免疫[13]，胸腺指數增加表明羅伊氏乳桿菌L2-2 可以增強小鼠的免疫功能。

血清生化指標檢測結果對于動物營養健康狀況具有重要參考價值。本研究結果發現，在小鼠灌服高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 后，小鼠血清GLOB 含量增加，同時降低了血清中TG 含量，而其他血清生化指標未受影響。血清GLOB 通常也稱為免疫球蛋白，可反映機體一定的免疫水平[14]。血清TG 是臨床血脂分析的重要指標，血脂高會導致血小板大量集聚，繼而導致心腦血管疾病的發生[15]。因此，羅伊氏乳桿菌L2-2 具有改善小鼠健康狀況的潛力。

本研究結果表明，小鼠連續7d 灌服劑量1 1010CFU/d的羅伊氏乳桿菌L2-2，小鼠體征和采食情況未受到不利影響，小鼠血液學檢查未見異常。細菌易位是指胃腸道內活菌穿過黏膜防御屏障，進入正常無菌的組織或器官，是評價細菌致病性的一個重要指標[16]。在小鼠灌服7 d 后，羅伊氏乳桿菌并未在原定居點腸道易位入其他組織發生感染。根據前人研究報道可知，半數致死量（LD50）是指導致死亡率50%的劑量，現已成為標志動物急性中毒程度的重要參數，在細菌濃度為5 1010CFU/mL時，對于6～8 周齡、體重20～25 g的雄性小鼠，羅伊氏乳桿菌L2-2 菌株口服LD50將大于10 mL/（kg·d），因此，預測體重100 kg 的驢駒每天服用超過1 L 的細菌是安全的[17]，可接受的每日攝入量是通常用在動物試驗（1 1010CFU/mL 濃縮飼料）的1 000 倍左右[18]。

本研究對從驢腸道內分離篩選到的羅伊氏乳桿菌在小鼠上進行了安全性評價，通過灌服大劑量羅伊氏乳桿菌研究其對小鼠的采食、生長情況、血清生化指標以及內臟細菌易位情況的影響，結果發現小鼠無中毒跡象，上述結果表明羅伊氏乳桿菌L2-2 菌株對小鼠具有非致病性，并能增加胸腺指數和血清中球蛋白含量，表明羅伊氏乳桿菌L2-2 能增強小鼠的免疫功能，而該菌的其他益生特性則有待進一步研究。