梅花鹿蠟片茸與血片茸脂質組分比較研究

唐麗昕，張然然，劉華淼，邢秀梅

（中國農業科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林 長春 130112）

梅花鹿鹿茸是一種傳統名貴中藥材，在我國已沿用兩千多年，其中脂質是鹿茸的重要組成部分[1]。段傳鳳等利用薄層色譜法分離出10 種磷脂組分（溶血磷脂酰膽堿、神經鞘磷脂、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、雙磷脂酰甘油和磷脂酸），利用氣相色譜法分離出10種脂肪酸（豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚烯酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸、花生酸、花生二烯酸和花生四烯酸），其中神經鞘磷脂和磷脂酰膽堿含量最高[2]。

隨著脂質研究日益受到關注，脂類代謝研究迅猛發展。2003年，Han等[4]首次提出了脂質組學（lipidomics）概念，即針對代謝產物中的脂質進行全面系統研究[3]。通過脂質組學研究可深入、全面地獲取生物中的脂質分子信息。脂質組學研究主要包括非靶向和靶向策略。非靶向脂質組學策略無偏地對生物樣品中整體脂質的變化進行分析，最大程度地反映樣品中脂質的變化規律和趨勢，從而找出差異標志物[5]；靶向脂質組學針對某一類或某幾類目標脂質進行準確的定性定量分析，常用于關鍵代謝通路或靶標的分析或驗證[6]。烏其爾·依熱格吉牧[7]利用非靶向代謝組鑒定到蘇尼特羊脂肪中171 種脂質代謝物，并探索了不同部位脂肪組織的差異脂質組份，劉宏艷[8]利用脂質組學技術鑒定到山羊奶中756 種脂質分子，并篩選到38 種脂質分子可用于鑒別山羊奶產地。

鹿茸是一種動物組織器官，其脂質組分是復雜的，利用組學技術可更深入、全面地獲取鹿茸脂質分子信息，將有助于鹿茸藥理活性物質的挖掘，以及不同區段茸片的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所需樣品為5 歲健康東北梅花鹿鮮鹿茸二杠茸（3 支）、三杈茸（3 支），采集于中國農科院特產研究所左家梅花鹿養殖場。根據中華人民共和國農業行業標準（NY/T 1162-2006）選取蠟片茸與血片茸。

試驗所需色譜級甲醇、乙腈、醋酸、甲醋銨和甲基叔丁基醚購自德國Merck公司。標準品購自美國Sigma公司，并用甲醇作為溶劑溶解后保存在-20℃。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜儀為日本島津UPLC CBM30A，串聯質譜儀為美國AB Sciex QTRAP?6500；色譜柱為Thermo C30 柱（2.1 100 mm，2.6m），超純水系統為德國Merck Millipore 公司。

1.3 試驗樣品脂質提取

稱取新鮮鹿茸樣品50±0.5 mg，置于EP 管中，加入300L冷甲醇、預冷鋼珠，20 Hz研磨3 min；加入1 mL冷MTBE（甲基叔丁基醚），置于冷水中超聲5 min；EP管中加入300L的0 ℃冰水，渦旋3 min，隨后放置于4 ℃冰箱中10 min；4 ℃、14 000 r/min 離心10 min，取上層清液，氮氣吹干，200L 乙腈/異丙醇（10/90，含0.04%乙酸，5 mmol/L 甲酸銨）復溶。將所有樣品提取物混合作為質控樣本（QC），用于監測分析樣本在相同處理方法下的重復性。在LC-MS-MS 分析過程中，每10 個檢測樣本中插入一個質控樣本。

1.4 色譜與質譜數據采集

數據采集儀器系統主要包括超高效液相色譜和串聯質譜。流動相：A 相為乙腈/水（60/40，含0.04%乙酸，5 mmol/L甲酸銨）；B 相為乙腈/異丙醇（10/90，含0.04%乙酸，5 mmol/L 甲酸銨）；液相梯度：0.0～3.0 min B 相20%～50%，3.0～5.0 min B 相50%～65%，5.0～9.0 min B相65%～75%，9.0～15.5 min B 相75%～90%；流動相流速0.35 mL/min，色譜柱溫度45 ℃，樣品進樣量2L。質譜數據采集條件：電噴霧離子源溫度550 ℃，質譜電壓5 500 V，簾氣35 psi，碰撞誘導電離參數設置為中。

1.5 質譜數據處理

基于自建靶向標準數據庫MWDB，利用軟件Analyst 1.6.3 軟件根據檢測物質的保留時間、子母離子對信息及二級圖譜數據進行定性分析。利用Multi Quant軟件對質譜下機文件進行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積代表對應物質的相對含量，最后導出所有色譜峰面積積分數據保存。利用R 語言進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）、聚類分析（Hierarchical cluster analysis，HCA）。使用SPSS 23.0 和Simca 14.1 軟件對數據進行差異分析和單變量統計分析。

2 結果

2.1 樣本質控分析

本試驗共加入了2 個QC 樣品，其質譜檢測總離子流圖（圖1）的疊加圖顯示代謝物檢測總離子流的曲線重疊性高，即保留時間和峰強度均一致，表明質譜對同一樣品不同時間檢測時，信號穩定性較好。

2.2 脂質代謝物鑒定

利用自建靶向標準數據庫，共檢索到752 種脂質代謝物，15 種代謝物類別。將每個脂質類別檢測到的所有脂質分子進行加合，得到脂質的總峰面積。由2可知，梅花鹿鹿茸中磷脂酰乙醇胺豐度最高，其次為磷脂酰膽堿和甘油三酯。對梅花鹿鹿茸的752 個脂質分子進行主成分分析，PC1 與PC2 兩個主成分累計貢獻率為57.87%。利用PC1、PC2 兩個主成分得分繪制散點圖，蠟片茸與血片茸可完全分開，可見PCA分析可以把樣品中脂質分子信息通過綜合的方式更直觀地表現出來（圖3）。

2.3 蠟片茸與血片茸差異脂質組分分析

通常代謝組等數據具有“高維、高噪聲和高變異”的特點，因此，差異代謝物的篩選通常采取結合單變量統計分析和多變量統計分析的方法，可避免只使用一種統計分析方法帶來的假陽性錯誤或模型過擬合。正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）結合了正交信號矯正（OSC）和PLS-DA（偏最小二乘判別分析）方法，能夠將X 矩陣信息分解成與Y 相關和不相關的兩類信息，通過去除不相關的差異來篩選差異變量。因此OPLS-DA解釋能力更強，可更準確地篩選出組間差異。

圖1 QC 樣本質譜檢測總離子流圖（TIC 圖）的疊加圖Fig.1 The total ion chromatograph(TIC)of QC sample by mass spectrometric detection

圖2 梅花鹿鹿茸脂質含量分析Fig.2 Analysis of lipid content in sika deer antler

圖3 PCA 得分圖Fig.3 PCA score

首先采用OPLS-DA 方法對T45 vs T65（圖4 a），M65 vs T65（圖4 b），M45 vs M65（圖4 c），M45 vs T45（圖4 d）四個比較組進行判別分析。交叉驗證結果均顯示R2 ＞Q2 ＞0.9，表明判別效果較好（圖4）。同時，采用單因素方差分析，篩選顯著差異表達脂質分子。共篩選到133 種差異脂質（VIP＞1，P＜0.05，差異倍數＞2），包含了7 個類別，具體為58 種甘油三脂，22 種磷脂酰膽堿，7 種磷酯酰絲氨酸，35 種磷脂酰乙醇胺，2 種溶血磷脂酰膽堿，5 種溶血磷脂酰乙醇胺，4 種神經酰胺（圖5，圖6）。從熱圖中可以看出相比于其他樣品M65 中的甘油三酯含量下調，磷酯酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿在T45 與T65 含量較高。另外3 種磷脂酰乙醇胺也在T45 與T65 中含量較高，分別為

LPE（0∶0/16∶0）、LPE（0∶0/16∶1）、LPE（0∶0/18∶0），而LPE（0∶0/20∶4）、LPE（0∶0/22∶5）在M45 與M65中含量較高。而3 種神經酰胺在M45 與M65 中顯示出較高的含量，分別為Cer（d18∶1/16∶0）、CerS（d18∶1/24∶0）、Cer（d18∶1/24∶1）。盡管T45 與T65的脂質組分含量較為相近，到仍篩選到5 種顯著差異組分，且皆為甘油三脂，TG（14∶0/20∶1/20∶4）、TG（14∶0/20∶4/22∶2）、TG（14∶0/20∶3/22∶3）、TG（18∶1/18∶3/20∶3）、TG（16∶0/20∶4/22∶3）。而且由熱圖可以看出，M45 與M65 最大的脂質差異組分也為甘油三脂。

圖4 各組OPLS-DA 得分圖Fig.4 OPLS-DA score

圖5 各組差異脂質分子數量統計Fig.5 Statistics on the number of lipid molecules in different groups

圖6 133 種差異脂質分子表達量熱圖Fig.6 Heat maps of 133 different lipid molecules

3 討論

鹿茸是一種名貴的中藥材，具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒等功效。質譜技術的不斷發展，不僅為鹿茸有效活性成分的挖掘提供了有利的技術支撐[9-14]，而且也為鹿茸產品的鑒別提供了新的思路[15,16]。

本研究利用UPLC-MS-MS 技術對二杠茸、三杈茸的蠟片茸與血片茸脂質組分進行了分析。共獲得了752 種脂質組分，其中磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、甘油三酯是梅花鹿鹿茸主要的脂質成分，而且蠟片含量均高于血片，這與之前的研究結果一致[17]。PCA 結果顯示不僅蠟片與血片區分明顯，而且二杠茸與三杈茸的血片也出現明顯的分離。

OPLS-DA 與單因素方差分析結果顯示有7 個類別的脂質化合物發生了顯著差異表達。磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰絲氨酸屬于甘油磷脂，是構成細胞膜的重要生物分子，參與了多種生物調節過程。李和平[19]對不同品種鹿茸的總磷脂含量進行分析，結果顯示不同品種鹿茸的總磷脂含量均由基部到頂部逐漸增加；王艷梅[19]的研究結果也顯示東北梅花鹿茸不同部位間總磷脂含量差異極顯著。這些脂質分子在蠟片茸中顯示高表達，推測這些脂質分子在鹿茸快速生長過程中起重要的調控作用。甘油三酯是動物體內含量最多的脂類，是長鏈脂肪酸和甘油形成的脂肪分子，大部分存在于乳糜微粒和極低密度脂蛋白內，機體可利用甘油三脂分解產物供給能量。梅花鹿鹿茸蠟片即鹿茸茸尖是鹿茸的生長中心，具有旺盛的生命活動，故而相比于血片需要更多的能量以維持其細胞增殖、分化等生命活動。神經酰胺是以神經酰胺為骨架的一類磷脂，是細胞間基質的主要部分，在保持角質層水分的平衡中起著重要作用，神經酰胺含量高低與皮膚干燥程度直接相關[20-21]。另外，神經酰胺可通過激活轉錄因子AP-1 調節信號轉錄，引起細胞凋亡[22-23]。而且神經酰胺衍生物可引起早期特殊核小體間DNA 破碎，這是細胞凋亡的外部特征[24]。因此推測，神經酰胺在鹿茸血片中的高表達，可能會引起血片茸的細胞凋亡過程。

4 結論

本研究利用UPLC-MS-MS 技術對二杠茸、三杈茸的蠟片茸與血片茸脂質組分進行了鑒定分析，結果顯示，磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿和甘油三酯是梅花鹿鹿茸主要的脂質成分，而且蠟片中含量較高，而神經酰胺類化合物在血片中表達量上調。本研究不僅為鹿茸有效成分的深入挖掘提供了數據支撐，更為梅花鹿蠟片茸與血片茸鑒別體系的建立奠定了理論基礎。