我國新生兒遺傳代謝病串聯質譜切值調查分析

何法霖， 林 博， 王 薇， 鐘 堃， 袁 帥， 杜雨軒， 王治國

（1.北京醫院 國家老年醫學中心 衛生健康委臨床檢驗中心/北京市臨床檢驗工程技術研究中心，北京 100730；2.浙江大學計算機科學與技術學院，浙江 杭州 310013）

先天代謝異常又稱遺傳代謝病，是指由于基因突變引起酶活性下降、細胞膜功能異常或受體缺陷導致機體生化代謝紊亂，造成反應底物、中間或旁路代謝產物蓄積，或終末代謝產物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一組特殊的疾病[1-2]。遺傳代謝病發病機制復雜，臨床表現多樣且缺乏特異性，診斷主要依賴對患兒血、尿及其他體液中特異性代謝物質的實驗室檢測。串聯質譜技術1次可檢測40多種指標，篩查數十種氨基酸、有機酸和脂肪酸氧化代謝病，越來越多的遺傳代謝病被診斷[3]。除開展室內質量控制和參加室間質量評價（external quality assessment，EQA）之外，保證篩查質量另一重要環節是篩查指標切值的設置，不恰當的切值會降低篩查效率、浪費醫療資源，并增加患者精神負擔[4]。國家衛生部臨床檢驗中心針對亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、瓜氨酸、游離肉堿、丙酰肉堿、丁酰肉堿、異戊酰肉堿、戊二酰肉堿、辛酰肉堿、癸酰肉堿、十四烷酰希酰肉堿、棕櫚酰肉堿、十八碳酰肉堿、3-羥基-十六碳酰肉堿和3-羥基-異戊酰肉堿共16項指標切值的現狀進行調查分析，旨在為遺傳代謝病串聯質譜切值的質量控制提供參考。

1 材料和方法

1.1 研究對象

2018年參加國家衛生健康委臨床檢驗中心新生兒串聯質譜篩查氨基酸和酰基肉堿EQA計劃的實驗室共151家，包括新生兒篩查中心、婦幼保健院及第三方檢測公司，涵蓋全國31個省自治區、直轄市。

1.2 研究方法

收集151家實驗室EQA計劃相關信息，包括：實驗室編碼、單位名稱、所在地區、指標切值、切值來源、方法學原理、儀器、試劑盒校準品及是否修改過切值。

1.3 統計學方法

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 19.0軟件對數據進行整理分析，經Kolmogorov-Smirnov檢驗顯示各組切值呈非正態分布。對16項指標的切值分布情況進行描述，包括中位數、最小值、最大值、百分位數。根據方法學原理對切值進行分析，并用秩和檢驗比較不同方法的組間差異，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新生兒串聯質譜篩查氨基酸和酰基肉堿16項指標切值來源分析

151家實驗室中，上報有效數據的實驗室為114家，16項指標的切值來源所占比例基本相同。有80家（70.18%）實驗室切值來源為試劑廠家說明書；除苯丙氨酸項目外，有18家（15.79%）實驗室切值位自行確定，有16家（14.04%）實驗室切值來源于文獻報道；苯丙氨酸項目有19家（16.67%）實驗室切值為自行確定，有15家（13.16%）實驗室切值來源于文獻報道。49.12%～53.51%的實驗室修改過切值。見表1。

表1 114家臨床實驗室16項指標切值修改情況

2.2 新生兒串聯質譜篩查氨基酸和酰基肉堿16項指標切值描述分析結果

使用串聯質譜篩查氨基酸和酰基肉堿16項指標按檢測方法分為衍生化檢測（24家）、非衍生化檢測（90家），按不同方法分組進行切值分析。其中瓜氨酸、游離肉堿分為2個切值，游離肉堿低值預示原發性系統肉堿缺乏癥，游離肉堿高值預示肉堿棕櫚酰轉移酶I缺乏癥；瓜氨酸低值預示鳥氨酸氨甲酰轉移酶缺乏、N-乙酰谷氨酸合成酶缺乏癥和氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥，瓜氨酸高值預示瓜氨血癥I型、精氨酰琥珀酸尿癥及希特林蛋白缺乏癥。結果顯示，16項指標不同檢測方法切值差異顯著（P＜0.05）。同一種檢測方法實驗室的切值也存在差異，采用衍生法檢測的實驗室間切值變異系數為25.26%～172.05%，采用非衍生法檢測的實驗室間切值變異系數為18.15%～200.92%，其中苯丙氨酸衍生法和非衍生法實驗室間的變異系數最小，3-羥基-十六碳酰肉堿衍生法和非衍生法實驗室間的變異系數最大，除瓜氨酸高值、亮氨酸、十四烷酰希酰肉堿和3-羥基-十六碳酰肉堿外，其他各項指標切值衍生法變異系數均大于非衍生法變異系數。見表2。

表2 串聯質譜不同方法切值的統計結果

2.3 不同篩查方法切值離散程度

根據篩查實驗室所用實驗方法以及開展串聯質譜以來是否修改過切值，繪制復合箱線圖。結果顯示，衍生法未修改切值的離散程度比修改過切值的離散程度更大。非衍生法除瓜氨酸低值外，其他指標未修改切值數據組與修改切值數據組離散程度相當，而瓜氨酸低值未修改過切值的數據比修改切值的數據離散程度大。見圖1。

圖1 16項指標按不同分類統計分析圖

3 討論

本研究涉及28個省市的141家開展串聯質譜新生兒遺傳代謝病篩查項目的臨床實驗室，能較全面地反映我國串聯質譜新生兒遺傳代謝病篩查切值設置現狀。從切值來源看，大部分實驗室選擇了試劑廠家說明書，14%的實驗室由自己確定，約50%的實驗室從未修改過切值。從篩查的方法看，78%（90/114）的實驗室使用非衍生法進行篩查，且使用非衍生法進行篩查的實驗室切值主要來源于試劑廠家說明書，而使用衍生法的24家實驗室切值主要由實驗室自己確定或來源于參考文獻。從切值百分位數分布結果看，第25位百分數與第75位百分數接近，但部分項目實驗室間差異較大。

氨基酸和酰基肉堿的切值是用于評價新生兒是否患有遺傳代謝病的指標，而不恰當的切值可能導致假陰性或者假陽性，造成臨床判讀的偏差，國家衛生健康委臨床檢驗中心2017年EQA計劃臨床判斷值的調查結果顯示，實驗室的臨床判斷值出現較大差異，35%的實驗室氨基酸和酰基肉堿臨床判斷值與預期結果不一致。分析原因發現，除其中32%的實驗室檢測濃度存在系統誤差外，68%的實驗室是由于切值設置不合理造成的。根據美國臨床生物化學研究院實驗室操作指南建議的串聯質譜新生兒遺傳代謝病篩查實驗室應篩選幾百份甚至上千份正常新生兒樣本，且篩選樣本新生兒的年齡應與實驗室實際篩查年齡一致，通過計算檢測結果的P1、P10、P99、P99位數，初步確定切值，高值為P99位數，低值為P10，再用1 000份新生兒樣本進行驗證，當陽性病例累積到一定數量時，高值可以選擇正常結果的99%位數到陽性結果的5%位數區間，低值可以選擇陽性結果的P99到正常結果的P1區間，實驗室確定切值需定期調整并驗證[5]。當然，切值設定的合理性還與室內質量控制息息相關，一般氨基酸類檢測項目變異系數在10%以內，肉堿類檢測項目變異系數在40%以內，只有穩定的檢測結果切值才具有臨床意義。

串聯質譜新生兒遺傳代謝病篩查不同于其他生化檢測，可1次檢測出數十種氨基酸及酰基肉堿，計算時再加入幾十個氨基酸或酰基肉堿之間的比值，最終由計算機軟件得出的結果可達100余項，并且1個指標可指向多種疾病，多個指標也可指向1種疾病，這就需要根據不同疾病的發病機制所導致的血中特異性氨基酸或酰基肉堿的異常進行分析，規則和切值設定，一直是困擾臨床的難點[5-6]。同時，串聯質譜檢測多種氨基酸和酰基肉堿的影響因素較多，如血斑的基質效應、內標物的穩定性、樣本的前處理過程等。此外，我國篩查實驗室區域性發展不平衡，浙江、上海、北京、廣州地區新生兒篩查中心串聯質譜篩查量大（＞3萬），其中浙江省兒童醫院年篩查量達40萬，而更多的實驗室才剛剛起步，年串聯質譜篩查量不足1萬[3]。另外，除苯丙酮尿癥外，其他遺傳代謝病發病率低，導致不少實驗室因陽性樣本不足而切值設置不合理。2005年，美國梅奧診所開發了美國區域性串聯質譜新生兒疾病篩查實驗室質量改進項目（Region 4 Stork，R4S），迄今為止已發展成為包含67個國家270個項目組的合作項目。R4S系統作為大樣本數據平臺，提供多種分析工具用于77種遺傳代謝病的篩查和診斷，該系統可以優化臨床特異性指標，評估現用切值，幫助實驗室提高陽性預測值[7]。浙江省兒童醫院回顧性分析了實驗室30多萬個篩查數據，并通過參與R4S計劃評估實驗室切值，從而提高了實驗室的陽性預測值。而美國R4S新生兒篩查數據庫的數據大都來源于非亞洲國家，是否完全適合我國新生兒篩查，能否作為金標準，是需要探討的問題。

總之，目前我國新生兒遺傳代謝病篩查串聯質譜切值差異較大，需要實驗室進行評估和驗證。國家衛生健康委臨床檢驗中心將在國家重點專項基金的支持下聯合全國新生兒篩查中心及浙江大學計算機科學與技術學院開發中國新生兒遺傳代謝病篩查串聯質譜切值評價平臺，進一步有效評價新篩實驗室切值。