磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物關鍵性能指標驗證

周碧燕， 趙麗萍， 陶文富， 方靈燕， 李少芳， 張可可， 何亞妮， 韋榮國

（南寧市第一人民醫院醫學檢驗科，廣西 南寧 530022）

由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染所致的乙型肝炎是最常見的病毒性肝炎。據統計，全球約有1/3的人曾感染HBV，2015年慢性HBV感染者約為2.57億人，占全球人口的3.5%，每年約有88.7萬人死于慢性HBV感染引起的肝硬化和肝細胞癌等相關疾病[1-2]。我國是目前世界上HBV感染人數最多的國家，1992年全國HBsAg攜帶者占總人口的9.75%，2006年下降到7.18%[3]，在1～29歲人群中，HBsAg的患病率從1992年的10.1%下降到2014年的2.6%。盡管如此，我國仍有7 700～9 700萬人患有慢性HBV感染，其中2 000～3 000萬人患有活動性肝病[4]。快速、及時、準確地檢測乙型肝炎6項血清標志物[乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎表面抗體（hepatitis B surface antibody，HBsAb）、乙型肝炎e抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）、乙型肝炎e抗體（hepatitis B e antibody，HBeAb）、乙型肝炎核心抗體（hepatitis B core antibody，HBcAb）、乙型肝炎前S1抗原（pre S1 antigen，PreS1Ag）]對乙型肝炎的防治具有重要意義。為此，本研究參照中國合格評定國家認可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的相關標準，對磁微粒化學發光法檢測血清HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的關鍵性能指標進行驗證，并統計該檢測系統使用前后的樣本周轉時間（turn-around time，TAT）。

1 材料和方法

1.1 樣本收集

收集2019年2—3月南寧市第一人民醫院醫學檢驗科完成檢測后剩余的臨床血清樣本，其中確診為乙型肝炎患者的血清樣本18份（患者男10例，女8例，年齡17～80歲）、體檢健康者血清樣本20份（男8名、女12名，年齡3～84歲）。

1.2 儀器與試劑

將Autolas B-1 Series免疫流水線分析系統（鄭州安圖生物工程股份有限公司，含4臺AutoLumo A2000Plus全自動化學發光測定儀、軌道系統、前處理系統和后處理系統）與配套試劑（磁微粒化學發光法）、校準品、質控品組成檢測系統（簡稱免疫流水線），嚴格按本實驗室標準操作規程進行操作。

1.3 檢測系統的性能驗證

1.3.1 精密度、線性范圍、可報告范圍、參考區間和檢出限的驗證 參照WS/T 420—2013[5]、WS/T 492—2016[6]、WS/T 494—2017[7]、CNASGL037：2019[8]和CNAS-GL038：2019[9]規定的方法對精密度、線性范圍、可報告范圍、參考區間和檢出限進行驗證。采用磁微粒化學發光法檢測20名體檢健康者的血清樣本，將結果與廠商提供的參考區間進行比較。如落在參考區間外的檢測結果不超過2個，則參考區間可直接使用，否則需重新建立參考區間。

1.3.2 樣本TAT 樣本TAT的計算參照MILER等[10]的方法。由于在使用免疫流水線前，當天檢測的樣本送達時間截止至上午10：30，10：30后送達的樣本放第2天檢測，而使用免疫流水線后，該時間點延長至下午15：00。因此，以當天10：30和15：00為時間截點，統計免疫流水線使用前后各1個月內（2019年3月和2019年8月）每天8：00—10：30和8：00—15：00接收的檢測乙型肝炎6項血清標志物的樣本在實驗室信息管理系統（laboratory information system，LIS）中從申請、接收、錄入、檢測到審核的時間，計算乙型肝炎6項血清標志物的TAT。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。TAT以中位數（M）[四分位數（P25～P75）]和90%百分位數（90%的樣本完成所需的時間）表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 精密度

磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的實驗室內變異系數（coefficient of variation，CV）均低于行業標準中的總不精密度（10%），批內s（重復性不精密度）和實驗室內不精密度的結果均低于重復性不精密度及總不精密度的驗證值。磁微粒化學發光法的精密度可接受。

2.2 線性范圍

根據廠商聲明的線性范圍，每個項目均收集高（H）、低（L）值血清樣本各1份，按L、4L+H、3L+2H、2L+3H、1L+4H、5H混合，每份混合血清重復檢測2次，取均值。以稀釋度為橫坐標，每個稀釋度的測定均值為縱坐標作線性回歸圖。若實測值和理論值的偏差在實驗室允許范圍（±5%）內，則可直接判定測定方法在所涉及的濃度范圍內呈線性。磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的線性回歸方程分別為HBsAgY=0.942 7X-4.702 8（r2=0.993 8），HBsAbY=0.994 6X-8.823 1（r2=0.999 1），HBeAgY=1.007 9X-1.093 3（r2=0.996 9），HBeAbY=0.992 8X-0.059 9（r2=0.995 4），HBcAbY=1.008 5X-0.005 3（r2=0.998 0）和PreS1AgY=0.980 8X+1.088 0（r2=0.998 7）。見圖1。

2.3 臨床可報告范圍

每個項目選取接近線性高值的樣本各1份，按照2、4、8、16倍稀釋（理論濃度），重復檢測2次，計算均值（稀釋濃度）。計算稀釋回收率[稀釋回收率（%）=稀釋濃度/理論濃度×100%]，以稀釋回收率在95%～105%范圍內作為可接受標準。磁微粒化學發光法檢測HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb和PreS1Ag的臨床可報告范圍分別為0.01～400.00 IU/mL、0.57～1 948.90 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～17.24 PEIU/mL、0.20～79.23 PEIU/mL和0.58～246.13 AU/mL，與廠商提供的臨床可報告范圍[0.01～200.00 IU/mL、0.57～974.45 mIU/mL、0.01～203.36 PEIU/mL、0.02～4.31 PEIU/mL、0.20～39.61 PEIU/mL、0.58～246.13 AU/mL]接近。

表1 磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的精密度

圖1 磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的線性回歸圖

2.4 參考區間

采用磁微粒化學發光法檢測20名體檢健康者的乙型肝炎6項血清標志物，檢測結果均落在廠商提供的參考區間內，參考區間驗證通過。

2.5 檢出限（limit of detection，LOD）

選取5份與廠家聲明的LOD水平相等的標準物質，每天測定1次，連續測定4 d，共獲得至少20個結果，如有超過95%的樣本的檢測結果大于廠家聲明的空白限（limit of blank，LOB），檢出限驗證通過。廠家聲明的HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb的LOD分別為0.03 IU/mL、3 mIU/mL、0.04 PEIU/mL、0.04 PEIU/mL和0.4 PEIU/mL，LOB分別為0.01 IU/mL、2 mIU/mL、0.02 PEIU/mL、0.03 PEIU/mL和0.2 PEIU/mL。所有檢測結果均大于廠家聲明的LOB，所有項目驗證通過。

2.6 樣本TAT

在使用免疫流水線后，雖然2019年8月的樣本量（3 113例）比2019年3月的樣本量（3 742例）增加了20%，但是8：00—10：30、8：00—15：00接收的和8：00—15：00接收但當天未出報告的樣本從接收到審核和從錄入到審核的時間分別減少了35%、54%，42%、22%，8%、53%；90%樣本的完成時間分別減少了14%、34%、79%、37%，44%、14%。與使用免疫流水線前的TAT比較，使用免疫流水線后的TAT明顯縮短（P＜0.000 1）。見表2。

表2 免疫流水線使用前、后TAT的比較

3 討論

HBV血清學標志物的檢驗是輔助診斷乙型肝炎的主要方法。HBV抗原和抗體常見的檢測方法為化學發光法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）和酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。2種檢測方法各有優缺點，ELISA操作便捷、成本較低，但易污染、靈敏度較低。CLIA較ELISA檢測重復性好，靈敏度高。對于病毒載量濃度較低或處于“窗口期”的獻血者，ELISA存在漏檢[11]，對于在免疫耐受期等患者的高值樣本，不同的CLIA檢測系統對HBsAg定量檢測存在偏差。因此，臨床上用HBsAg進行抗病毒治療監測時應選擇同一種檢測系統[12]。

目前，國內報道的性能驗證研究大部分是基于美國臨床實驗室標準化協會的相關文件（EP15-A2、EP6-A2、EP7-A2和C28-A2等）或美國臨床實驗室改進修正法規進行方案設計，但有些性能指標需要根據實驗室要求或本地法規自行建立，有些性能指標并無判斷標準。本研究同時參照相關文件，綜合確定了驗證方案，對磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的各項性能指標進行了較為完整的評價。

本研究結果顯示，磁微粒化學發光法檢測乙型肝炎6項血清標志物的批內s、批間方差和實驗室內s均符合要求，線性回歸的r2值＞0.995，均符合要求。檢測20名體檢健康者的乙型肝炎6項血清標志物，檢測結果均落在廠商提供的參考區間內，參考區間驗證通過。采用磁微粒化學發光法檢測與廠家聲明的LOD水平相當的樣本的乙型肝炎5項血清標志物，其檢測結果均大于廠家聲明的LOB，LOD驗證通過。廠家聲明的HBsAg和HBsAb的LOD分別為0.03 IU/mL和3 mIU/mL，根據WS/T 494—2017的要求，用于診斷感染性疾病抗原和抗體的測定方法的最低檢出限越低越好，磁微粒化學發光法檢測HBsAg和HBsAb的最低檢出限應低于0.1 IU/mL和10 mIU/mL[7]，驗證結果滿足WS/T 494—2017的要求。

TAT是指實驗室從收到樣本到出具報告的時間（以min為單位）。本研究結果顯示，使用免疫流水線顯著提升了實驗室的檢測效率，TAT明顯縮短，有些項目甚至縮短了79%以上。本實驗室在使用免疫流水線前，每次檢測乙型肝炎6項血清標志物時需湊夠96人份才能上機檢測，操作繁瑣，而免疫流水線能做到樣本隨到隨測，操作簡便，符合實驗室的預期要求和工作要求。另外，由于免疫流水線可以隨時檢測樣本，因此本實驗室把接收樣本的時間延長至下午15：00點。另外，該免疫流水線能滿足2 h內出報告和24 h急診的需求，因此可以滿足臨床個別科室將一些傳染病項目列為急診的要求，極大的方便了患者和臨床，降低了患者看病的時間成本。

綜上所述，磁微粒化學發光法的關鍵性能指標均符合臨床要求，使用免疫流水線可大幅縮短TAT，有較大的臨床應用價值。