異基因造血干細(xì)胞移植后細(xì)胞免疫重建與真菌感染的相關(guān)性

彭新國， 孫長華， 安佳佳， 崔艷芳， 董 艷， 王 健， 高梅蘭

（濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，山東 濱州 256603）

異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是實(shí)體瘤、惡性血液病、免疫缺陷等疾病的有效治療手段。allo-HSCT后造血功能恢復(fù)較快，多數(shù)患者在移植后2～3周即可獲得粒細(xì)胞和血小板重建，但免疫重建過程卻有所延遲[1]。allo-HSCT后的免疫重建分為固有免疫系統(tǒng)的重建和特異性免疫系統(tǒng)的重建。前者包括粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等，常在移植后2～4周獲得重建；后者包括T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，移植后重建非常緩慢，尤其是CD4+T細(xì)胞[2]。allo-HSCT患者的免疫重建在防止疾病復(fù)發(fā)、降低死亡率等方面有重要作用，免疫重建延遲與感染和繼發(fā)腫瘤等密切相關(guān)[3]。侵襲性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）是allo-HSCT后患者死亡的主要原因之一，在機(jī)體的抗真菌作用機(jī)制中，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫應(yīng)答發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4]。外周血中初始CD4+T細(xì)胞在不同細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可分化為不同亞群的效應(yīng)T細(xì)胞，各自分泌不同的細(xì)胞因子，在免疫應(yīng)答中執(zhí)行不同功能。為進(jìn)一步探討allo-HSCT后CD4+T細(xì)胞免疫重建特征及其與IFI的關(guān)系，本研究從細(xì)胞和細(xì)胞因子水平檢測不同亞群效應(yīng)T細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)的變化。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2010年2月—2014年10月濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院行allo-HSCT的血液惡性腫瘤患者47例，其中男33例、女14例，年齡（38±17）歲；47例患者中，急性髓性白血病34例、急性淋巴細(xì)胞白血病8例、慢性髓細(xì)胞白血病5例；同胞供者移植38例、無血緣供者移植9例；供受者組織相容性白細(xì)胞抗原（histocompatibility leukocyte antigen，HLA） 9/10位點(diǎn)以上相合2例、全相合45例；清髓性預(yù)處理方案含抗胸腺細(xì)胞球蛋白17例、不含30例；急性移植物抗宿主病預(yù)防方案為他克莫司+雷帕霉素+嗎替麥考酚酯30例、環(huán)孢素+MTX+MMF17例。另選取同期、同院體檢健康者40名為對照組，其中男28例、女12例，年齡（38±18）歲。

1.2 方法

1.2.1 移植后免疫細(xì)胞亞群數(shù)量檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測移植后免疫細(xì)胞亞群數(shù)量。采集研究對象清晨空腹外周血5 mL，肝素抗凝，1 000×g離心5 min，取白細(xì)胞膜層，采用密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞層。以適量RPMI 1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清+100 U/mL青鏈霉素重懸單個核細(xì)胞，細(xì)胞濃度為2×106個/mL。將細(xì)胞懸液以每管250 μL的量分裝入編號為1、2、3、4、5、6的Eppendorf管中。1、2號管置于37 ℃、5%CO2溫箱孵育4～6 h，1 000×g離心5 min，棄上清，行流式細(xì)胞術(shù)。應(yīng)用BD Diva軟件分析CD4+細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例，并結(jié)合外周血淋巴細(xì)胞絕對數(shù)計算調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及CD4+細(xì)胞絕對數(shù)。3～6號管中加入1 μL佛波酯/離子霉素混液及1 μL布雷菲萊德菌素A/莫能霉素混液，使4個管內(nèi)終濃度分別為50 ng/mL、1 μg/mL、3 μg/mL及1.4 μg/mL，然后置于37 ℃、5% CO2溫箱孵育4～6 h，1 000×g離心5 min，取上清，行流式細(xì)胞術(shù)。應(yīng)用BD Diva軟件分析輔助性T細(xì)胞（helper T cell，Th）17、Th1、Th2占CD4+T細(xì)胞的比例，并根據(jù)外周血淋巴細(xì)胞絕對數(shù)計算各亞群細(xì)胞的絕對數(shù)。所有試劑均購自美國BECKMAN公司，CD4為FITC熒光標(biāo)記。BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（4/2系統(tǒng)）購自美國BD公司。

1.2.2 細(xì)胞因子濃度檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測細(xì)胞因子濃度。采集研究對象清晨空腹外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，1 000×g離心5 min，取上清，檢測白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、干擾素（interferon，IFN）-γ和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β的濃度。采用美國伯樂公司imark酶標(biāo)儀進(jìn)行測定，所有試劑盒均購自美國BioLegend公司，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察allo-HSCT后CD4+T細(xì)胞免疫重建特征。比較對照者與血液惡性腫瘤患者移植后1、2、3個月的CD4+T細(xì)胞、Th17、Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)量。觀察連續(xù)3個月均進(jìn)行檢測的患者的細(xì)胞因子水平動態(tài)變化，并與對照組進(jìn)行比較。觀察患者移植后IFI發(fā)生情況，并分析其與CD4+T細(xì)胞免疫重建的相關(guān)性。IFI的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)與治療原則（第五次修訂版）》[5]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SAS 9.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以x±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，采用獨(dú)立樣本的Mann-WhitneyU檢驗；CD4+T細(xì)胞免疫重建相關(guān)指標(biāo)與IFI相關(guān)性分析采用多因素Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 allo-HSCT后不同時間免疫細(xì)胞亞群數(shù)量

采用兩方差分析對allo-HSCT后不同時間免疫細(xì)胞亞群數(shù)量進(jìn)行兩兩比較。結(jié)果顯示，移植后1、2和3個月免疫細(xì)胞亞群數(shù)量均低于對照組（P＜0.05），移植后2、3個月免疫細(xì)胞亞群數(shù)量均高于移植后1個月（P＜0.05）。見表1。

表1 allo-HSCT后不同時間免疫細(xì)胞亞群數(shù)量 ×106/L

2.2 allo-HSCT后不同時間細(xì)胞因子水平動態(tài)變化

移植后1、2和3個月IL-6水平逐漸升高，且與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），2個月時達(dá)到峰值，隨后開始降低，但移植后3個月IL-6水平仍高于對照組（t=10.501，P＜0.001）；與對照組比較，移植后1、2和3個月IL-10水平均升高，移植后2個月較1個月降低，3個月回升至最高，移植后2個月與對照組比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（t=13.530，P＜0.001）；移植后TGF-β水平下降，移植后1、2和3個月各組與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；移植后不同時間IFN-γ與對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 allo-HSCT后不同時間細(xì)胞因子水平 pg/mL

2.3 IFI發(fā)生情況及其與CD4+T細(xì)胞免疫重建的相關(guān)性

參照臨床診療結(jié)果，本研究IFI發(fā)生率為19.15%（9/47），其中55.56%（5/9）的病原菌為念珠菌，44.44%（4/9）為曲霉菌；55.56%（5/9）的感染部位為肺部，33.33%（3/9）為口咽部，22.22%（2/9）為腸道（1例患者同時有2個部位發(fā)生感染）。

以是否發(fā)生IFI為因變量，以CD4+T細(xì)胞4個亞群細(xì)胞數(shù)以及細(xì)胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TGF-β為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，入選標(biāo)準(zhǔn)為0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為0.1。結(jié)果顯示，Th17細(xì)胞數(shù)可能與IFI的發(fā)生有關(guān)，而Th1、Th2和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)以及IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平與IFI的發(fā)生無關(guān)。見表3。

3 討論

allo-HSCT后，因移植方案中應(yīng)用了大劑量細(xì)胞毒性藥物及長期免疫抑制藥物而影響了免疫重建，患者將經(jīng)歷較長時間的免疫缺陷，從而增加了對病原微生物的易感性[6-7]。IFI是allo-HSCT后常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，即使給予積極的抗真菌治療，患者仍有較高的發(fā)病率與死亡率[8]。但并非所有的患者都會出現(xiàn)IFI，提示存在某些未知因素導(dǎo)致患者對IFI有個體差異，因此明確IFI與CD4+T細(xì)胞免疫重建是否具有相關(guān)性，對幫助臨床制定相應(yīng)的治療策略具有重要意義。

allo-HSCT后T細(xì)胞重建有2條途徑：一條是胸腺依賴性途徑，供者來源的前T細(xì)胞在胸腺內(nèi)發(fā)育；另一條是胸腺非依賴性途徑，即成熟T細(xì)胞的外周擴(kuò)增。前者是移植后T細(xì)胞的主要來源，產(chǎn)生初始T細(xì)胞，啟動緩慢；后者主要是記憶T細(xì)胞，能夠在抗原與細(xì)胞因子的刺激下迅速轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞，執(zhí)行免疫應(yīng)答，是移植后早期淋巴細(xì)胞急劇下降、胸腺功能未恢復(fù)時的重要替代途徑，在移植后早期的抗感染機(jī)制中發(fā)揮著重要作用[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，移植后CD4+T細(xì)胞及其免疫亞群數(shù)量隨時間延長而遞增，但移植后3個月亞群細(xì)胞數(shù)仍低于對照組，可能與外周血中的初始CD4+T細(xì)胞數(shù)量不足有關(guān)。即使受到足夠的抗原或者細(xì)胞因子誘導(dǎo)，在無足夠初始CD4+T細(xì)胞的情況下，也無法正常活化為各亞群細(xì)胞。此外，也可能是由于移植后患者T細(xì)胞受體庫多態(tài)性不足，導(dǎo)致抗原應(yīng)答能力減弱，向效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力減弱及CD4+T細(xì)胞亞群重建延遲。

本研究檢測了Th1類因子IFN-γ、Th2類因子IL-6和IL-10、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞類因子TGF-β，結(jié)果顯示，TGF-β在移植后3個月內(nèi)持續(xù)低于對照組，而IL-6、IL-10在移植后3個月內(nèi)持續(xù)高于對照組，IFN-γ與對照組比較無差異。這可能是由于上述細(xì)胞因子除了來源于CD4+T細(xì)胞外，還可由移植后恢復(fù)較快的單核巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等分泌。這些細(xì)胞的活化導(dǎo)致某些細(xì)胞因子水平不變甚至升高。

本研究結(jié)果顯示，IFI可能與Th17細(xì)胞數(shù)有關(guān)，而與Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)以及IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ水平無關(guān)。此外，Th17是IFI發(fā)生的保護(hù)因素，提示及時對移植后患者進(jìn)行Th17檢測，可預(yù)測患者IFI發(fā)生率。但本研究受病例數(shù)限制，研究結(jié)果尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以證實(shí)。