SD乳鼠原代心臟成纖維細胞培養(yǎng)及鑒定*

楊艷，歐陽偉煒，蘇勝發(fā)，馬筑，李青松，耿一超，盧冰

(1.貴州醫(yī)科大學附院 腫瘤科，貴州省腫瘤醫(yī)院 腫瘤科，貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學 腫瘤學教研室，貴州 貴陽 550004)

成纖維細胞是疏松結(jié)締組織中最主要的細胞，可分泌多種生長因子調(diào)節(jié)細胞增殖及分化。成纖維細胞是心臟組織的主要組成成分，相關研究發(fā)現(xiàn)出生后1 d時大鼠心臟成纖維細胞約占30%，出生后15 d時則約占64%[1]。成纖維細胞主要是通過合成及分泌膠原蛋白、纖連蛋白等細胞外基質(zhì)，提供給心臟一個完整的網(wǎng)狀支撐系統(tǒng)，在維持心臟結(jié)構(gòu)、功能、生物化學和電機械信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮重要作用[1-3]。心臟成纖維細胞已用于心肌梗死后心臟纖維化、缺血缺氧再灌注、血管重構(gòu)等體外研究模型，是目前研究心血管疾病的方法之一[4-6]。鼠心臟成纖維細胞培養(yǎng)方法主要包括酶消化法及組織塊貼壁法。酶消化法主要包括胰蛋白酶消化、蛋白酶消化過夜再用Ⅱ型膠原蛋白酶消化以及蛋白酶混合Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化，分別用胰酶、Ⅱ型膠原酶依次消化分離心肌組織，再通過兩次差速貼壁分離法等。在實驗中所采用酶種類、濃度、順序、消化時間及次數(shù)，是否水浴過夜、差速貼壁的次數(shù)、消化程度等均有所不同，本實驗采用兩種酶混合短時間多次消化的方法進行消化分離心臟成纖維細胞，通過觀察培養(yǎng)的乳鼠心臟成纖維細胞、探討其在胸部放射治療中導致心臟放射性損傷的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1動物 出生24 h SPF級SD大鼠乳鼠30只，雌雄不限，體質(zhì)量(6±0.5)g，實驗動物由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供。

1.1.2主要儀器和試劑 超凈工作臺，4～20 ℃冰箱，5% 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，細胞離心機，細胞爬片。DMEM高糖培養(yǎng)基(gibco公司，美國)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(gibco公司，美國)，0.2%膠原酶Ⅱ(Sigma 公司，美國)、兔抗Vimentin單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗鼠二抗(北京中杉金橋有限公司)。

1.2 方法

1.2.1取材 將SD乳鼠置于75%酒精缸中浸泡10 s，劍突向上剖開胸腔、暴露心臟，用無菌眼科剪剪取心尖置離心管的PBS液中冰凍，將取好的心臟組織轉(zhuǎn)移至細胞培養(yǎng)房的超凈工作臺中，用預冷的PBS漂洗3～5次后放入已滅菌的青霉素小瓶中，充分剪碎心臟成糜肉狀，再次漂洗3～5次，將糜肉狀的心臟組織平均分裝至5～6支15 mL離心管中。

1.2.2酶消化分離培養(yǎng) 將消化酶與剪碎的心臟組織體積按1 ∶3的比例加入15 mL離心管中，加入0.25%胰蛋白酶及0.2% Ⅱ型膠原酶以1 ∶1混合，吹打30～60 s封口后轉(zhuǎn)移于37 ℃恒溫水浴鍋中充分震蕩搖晃8～10 min，用無菌吸管吸取上清后用100目的篩網(wǎng)過濾；將收集的上清液放入15 mL離心管，并加入同體積的細胞培養(yǎng)液。將15 mL離心管中未消化的組織再次加入消化酶并吹打30～60 s后再次轉(zhuǎn)移至于37 ℃恒溫水浴鍋中充分震蕩搖晃8～10 min后吸取上清，同法消化3～5次至組織消失，僅剩下白色透明的膠原纖維組織。

1.2.3細胞培養(yǎng) 將分次收集的細胞懸液以1 000 r/min，5 min離心2次，棄掉上清液，加入10%胎牛血清高糖DMEM 5 mL重懸細胞，調(diào)整細胞密度后接種到25 mL培養(yǎng)瓶中。移到5% 37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)90～120 min，差速貼壁后，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)心肌細胞，補充10%胎牛血清高糖DMEM于培養(yǎng)瓶中，再置于5% 37 ℃的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d換1次培養(yǎng)液。當心臟成纖維細胞生長鋪滿瓶底體積達 80%～90%時，用2.5 g/L 胰蛋白酶1 mL消化細胞進行傳代。

1.2.4心臟成纖維細胞鑒定 (1)形態(tài)學觀察，將培養(yǎng)的原代心臟成纖維細胞在0、24、48及72 h時間點用100倍數(shù)倒置相差顯微鏡觀察原代成纖維細胞形態(tài)學特征。(2)Vimentin免疫組化染色鑒定，選2～4代的心臟成纖維細胞，按5X104接種于置有細胞爬片的12孔板中，于5% 37℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h。用多聚甲醛固定40 min，H2O2室溫孵育30 min，Tritonx-100通透30 min，BSA室溫封閉。加入200 μL不同濃度的Vimentin抗體，置于4 ℃冰箱孵育過夜，加入100 μL二抗，室溫孵育30 min。DAB閉光染色，蘇木素復染。將細胞爬片通過不同濃度梯度的酒精脫水。用二甲苯透明，中性樹膠封片。染色完成后立即進行倒置顯微鏡觀察細胞染色。

2 結(jié)果

2.1 心臟成纖維細胞的生物學特性

培養(yǎng)90～120 min時可見較多貼壁的成纖維細胞，在倒置顯微鏡下呈球形亮點或已貼壁生長的細胞(圖1A)；24 h后細胞逐漸由圓形伸展為三角形、扁平形、長梭形及不規(guī)則多邊形，且貼壁細胞數(shù)量增多(圖1B)；培養(yǎng)2 d后可見成纖維細胞數(shù)量較前增多，形態(tài)多樣且輪廓清晰，部分有多個偽足突起，細胞核邊界清楚，核仁明顯，細胞增殖能力增強，生長加速(圖1C)；第3天時細胞數(shù)量明顯增加，細胞鋪滿瓶底70%以上，部分區(qū)域細胞互相匯合無空隙，細胞形態(tài)以長梭形、不規(guī)則多邊形為主(圖1D)。因消化后心臟組織內(nèi)多種細胞會混合生長，部分區(qū)域細胞可見成簇生長，呈扁平狀排列，可能為內(nèi)皮細胞。培養(yǎng)的原代成纖維細胞中可見散在的細胞呈長梭形，折光性更強；有時可見細胞搏動，為心肌細胞(圖1B、圖1C及圖1D)，因心肌細胞為不可再生細胞，一般傳至第二代后則以成纖維細胞為主。

注： A～D分別為培養(yǎng)2、24、48及72 h。箭頭所示為心肌細胞。 圖1 原代培養(yǎng)的成纖維細胞(100×)Fig.1 The primary culture of cardiac fibroblasts at different time points under phase contrast microscope(100×)

2.2 心臟成纖維細胞純度

培養(yǎng)的細胞經(jīng)vimentin 免疫組化染色后在倒置顯微鏡下可見細胞質(zhì)染為黃色，細胞核染為紫色，染色率達90%以上(圖2)，提示細胞純度較好。

2.3 培養(yǎng)過程中的細胞污染

本實驗在原代細胞培養(yǎng)48 h時出現(xiàn)細菌污染(圖3A、B)，圖A顯示為支原體污染，菌體呈線狀或多形性，圖B顯示為黑蛟蟲污染，呈黑點狀，培養(yǎng)基混濁，細胞形態(tài)發(fā)生改變，甚至裂解死亡。

3 討論

心臟主要由成纖維細胞、心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞等組成。心臟成纖維細胞是心臟纖維化的關鍵效應細胞[7]心臟成纖維細胞的遷移及增殖能力極強，與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展息息相關[8-10]，與多種心臟疾病發(fā)生發(fā)展相關，如高血壓性心肌肥厚、肥厚性心肌病、缺血性心肌病以及放射性心臟損傷等，故建立一種穩(wěn)定、有效的體外心臟成纖維細胞對臨床心血管疾病的研究、防治有著深遠意義。

圖2 免疫組化檢測Vimentin在成纖維細胞表達(100×)Fig.2 Immunohistochemical detection of Vimentin expression in cardiac fibroblasts(100×)

注：圖A箭頭所示為支原體污染(臺盼藍染色)，圖B箭頭所示為黑蛟蟲污染。圖3 原代培養(yǎng)48 h時細菌污染結(jié)果(100×)Fig.3 Bacterial contaminationat primary culture 48 h(100×)

目前關于心臟成纖維細胞的原代培養(yǎng)方法較多，大多都是從成年鼠或乳鼠心臟中分離培養(yǎng)[11-15]，也可從胚胎鼠心臟中分離培養(yǎng)心臟成纖維細胞[16]，較為常用的是酶消化法及組織塊貼壁法。酶消化法包括單純胰蛋白酶消化[17-18]、消化過夜再用Ⅱ型膠原蛋白酶消化[19-20]以及蛋白酶混合Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化[14]。消化法是利用消化酶將基質(zhì)、纖維等消化去除，從而使細胞分離出來。胰蛋白酶主要作用是分解蛋白質(zhì)，對細胞膜破壞力強，消化細胞時若時間控制不好易造成細胞損傷。膠原酶以消化膠原為主，作用緩和。劉美麗等[21]取SD 成年大鼠心臟成纖維細胞，對不同消化酶組合及不同時間點進行比較，最后發(fā)現(xiàn)單用膠原酶消化60 min 所得細胞數(shù)量最多，且細胞狀態(tài)佳、死亡率低、增值能力強等。

本研究在前期實驗應用胰蛋白酶消化乳鼠心臟組織，消化時間較長且不完全，提取細胞數(shù)量較少，消化后細胞活力差，生長速度慢，提取的細胞貼壁后雜質(zhì)較多，傳代后細胞增值能力差且狀態(tài)不佳。主要因為胰蛋白酶消化時間長且消化不完全，對已消化的細胞破壞強，導致細胞活力下降。后調(diào)整為胰蛋白酶及Ⅱ型膠原酶按1 ∶1混合置于37 ℃水浴箱中進行短時間多次消化，所提取細胞量多，且細胞生長快，約3～4 d時可生長約90%，細胞雜質(zhì)少，傳代后生長速度快，且細胞狀態(tài)好。實驗過程中無菌操作、細胞貼壁時間長短、細胞換液的頻率、實驗室環(huán)境也是影響原代成纖維細胞分離培養(yǎng)的重要條件。乳鼠生長的實驗室安全級別達到要求，手術(shù)器械需要高壓滅菌，超凈臺需要紫外線照射及75%乙醇等提前消毒，乳鼠浸泡75%乙醇中時間約10 s為佳，取出的心臟組織需置于冰盒中PBS液中冰凍以減少心臟缺血缺氧損傷時間，冰凍的心臟組織清洗雜質(zhì)后盡快提取細胞。實驗過程污染與無菌操作不規(guī)范及實驗室環(huán)境相關。劉姿麟等[22]養(yǎng)大鼠血管平滑肌過程中出現(xiàn)霉菌污染。總之在細胞培養(yǎng)過程中每一步均需嚴格遵照無菌操作流程。

本研究通過不斷反復實驗及調(diào)整實驗方法、條件等，通過觀察心臟成纖維細胞體外培養(yǎng)生長情況及培養(yǎng)的第二代成纖維細胞并經(jīng)Vimentin免疫熒光鑒定，證實本研究在實驗室成功建立了一種穩(wěn)定、有效的原代成纖維細胞培養(yǎng)方法。為后續(xù)實驗順利進行奠定基礎。