核酸內(nèi)切酶G在帕金森病大鼠腦組織中的表達及意義*

武林，任真奎, 呂菊, 謝鵬, 胡玉梅, 吳昌學**，禹文峰**

(1.黔西南州人民醫(yī)院 輸血科，貴州 興義 562400； 2.貴州醫(yī)科大學 分子生物學重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學 地方病與少數(shù)民族疾病教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 4.黔西南州人民醫(yī)院 檢驗科，貴州 興義 562400)

帕金森病 (parkinson's disease, PD) 又稱為震顫性麻痹，是居于阿爾茨海默病后的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其病理基礎主要是多巴胺能神經(jīng)元進行性變性丟失。研究表明，細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)在PD的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，尤其是細胞凋亡更被認為是PD病理機制中多巴胺能神經(jīng)元死亡的主要方式之一[2-4]。以往的研究表明，Caspase依賴型凋亡在這一過程中起重要作用，但最近有越來越多的研究表明非Caspase依賴型凋亡也參與了巴胺能神經(jīng)元死亡[5-6]。核酸內(nèi)切酶G(endonuclease-G，Endo-G)是一種Mg2+依賴非特異性核酸內(nèi)切酶，是非Caspases依賴性凋亡通路的重要作用因子；嚴重的氧化應激、細胞內(nèi)的鈣超載以及缺血過程中能夠誘導Endo-G從線粒體釋放到胞漿中，并隨即轉(zhuǎn)位至胞核中，導致核小體DNA碎片化，誘導細胞凋亡[7-8]。本實驗通過研究在6-羥多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)誘導建立的PD大鼠模型中Endo-G表達及轉(zhuǎn)位情況，探討Endo-G介導的非Caspase依賴型凋亡在巴胺能神經(jīng)元變性丟失過程中的作用和分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性SD大鼠[SYXK(黔)2018-0001]由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，阿撲嗎啡、6-羥基多巴胺和抗壞血酸購自美國Sigma公司，Endo-G抗體、Cox-4抗體、H3抗體和山羊抗小鼠抗體購自美國Santa公司，BCA試劑盒和細胞核蛋白提取試劑盒購自美國Thermor公司，ABC免疫組織化學試劑盒購自美國Vector公司，線粒體提取試劑盒購自英國Abcom公司。

1.2 方法

1.2.1實驗動物及模型建立 30只SPF級雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為PD模型組(PD組)和假手術(shù)組(Ctrl組)，每組15只。通過立體定位儀向PD組大鼠右側(cè)紋狀體(A/P 為1 mm，L/M 為3 mm，D/V 為-5 mm)注射6-OHDA(5 g/L，溶于含0.02%抗壞血酸的生理鹽水中)4 μL誘導建立單側(cè)損毀PD大鼠模型；Ctrl組則注射生理鹽水(含0.02%抗壞血酸)4 μL作為對照[9]。術(shù)后第3周，通過阿撲嗎啡 (apomorphine, APO )誘導的旋轉(zhuǎn)行為學實驗對6-OHDA誘導的PD大鼠模型進行篩選，即腹腔注射APO(APO 2 mg /kg溶于生理鹽水中)誘發(fā)大鼠向健側(cè)旋轉(zhuǎn)，記錄40 min內(nèi)向健側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)圈速>2 r/min的大鼠視為成功的PD模型大鼠[10]。

1.2.2蛋白印跡實驗(Western Bolt)檢測大鼠黑質(zhì)線粒體內(nèi)和細胞核內(nèi)Endo-G的表達 術(shù)后第四周，將大鼠斷頸處死，迅速取出大腦并分離出左、右側(cè)黑質(zhì)，用線粒體蛋白提取試劑盒(ab-110169，abcom)提取大鼠黑質(zhì)線粒體蛋白，用細胞核蛋白提取試劑盒(Pierce 78833，Thermor)提取大鼠黑質(zhì)細胞核蛋白。采用BCA蛋白定量法對提取的黑質(zhì)線粒體蛋白和細胞核蛋白進行定量，取10 μg蛋白變性后經(jīng)12% SDS-PAGE電泳，再將蛋白轉(zhuǎn)至0.22 μm PVDF膜上，經(jīng)5% BSA封閉60 min后，滴加Endo-G一抗(1 ∶500，sc-365359，Santa)4 ℃孵育過夜，用0.1% TBST洗膜3次(5 min/次)后，加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG(1 ∶1 200，sc-2005，Santa) 室溫孵育60 min，用0.1% TBST清洗3次(5 min/次)，最后進行ECL化學發(fā)光顯影，線粒體內(nèi)Endo-G表達量以COX-4為內(nèi)參進行統(tǒng)計分析；細胞核內(nèi)Endo-G表達量以Histone-3為內(nèi)參進行統(tǒng)計分析。通過Endo-G免疫組化染色觀察Endo-G在黑質(zhì)區(qū)的表達與分布情況，黑質(zhì)區(qū)Endo-G免疫染色陽性細胞中，神經(jīng)元為空心視為未發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞，若神經(jīng)元為實心視為發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞，統(tǒng)計各組黑質(zhì)細胞中發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞占Endo-G陽性細胞數(shù)的比例(Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞率)。

1.2.3大鼠黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)和Endo-G的變化 術(shù)后第4周，用10%水合氯醛將大鼠麻醉后，打開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室灌注生理鹽水至肝臟變白后，再灌注4 %多聚甲醛(含0.1%苦味酸)至四肢、尾巴變黃后，取出腦組織放入含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液中固定24 h。梯度脫水，石蠟包埋，在大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)做4 μm連續(xù)切片。切片經(jīng)脫蠟、水化后，用0.3%過氧化氫溶液孵育15 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性，10%山羊血清封閉60 min；小鼠單克隆抗TH抗體(1 ∶300)或小鼠單克隆抗Endo-G抗體(1 ∶200)在4 ℃下孵育過夜，TBST洗3次(5 min/次)，山羊抗小鼠IgG(1 ∶500)室溫孵育60 min，TBST洗3次(5 min/次)，ABC復合物室溫孵育30 min，TBST洗3次(5 min/次)，DAB顯色，脫水、透明，中性樹脂封片后，顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH

Ctrl組TH染色陽性神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整，胞體飽滿，邊緣清晰；PD模型組大鼠損毀側(cè)黑質(zhì)部位TH染色陽性細胞很難見完整的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，難以見到完整的細胞輪廓；表明在PD模型大鼠損毀測區(qū)域黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生變性和丟失。見圖1。

圖1 各組大鼠黑質(zhì)內(nèi)TH的表達(免疫組織化學染色)Fig.1 Expression of TH detected by IHC staining in the different groups(Immunohistochemical)

2.2 左、右側(cè)黑質(zhì)線粒體和黑質(zhì)細胞核中Endo-G表達

Ctrl組中，左、右側(cè)黑質(zhì)線粒體和黑質(zhì)細胞核中Endo-G表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。在PD組中，右側(cè)黑質(zhì)線粒體中Endo-G表達量較左側(cè)明顯下降(P<0.05)，右側(cè)黑質(zhì)細胞核中Endo-G表達量較左側(cè)明顯上升(P<0.05)。見圖2、圖3和表1。

注： L為左側(cè)，R為右側(cè)；(1)與左側(cè)相比，P<0.05。圖2 大鼠左、右側(cè)黑質(zhì)線粒體中Endo-G蛋白的表達Fig.2 Expression of Endo-G protein in mitochondria in the different groups

注： L為左側(cè)，R為右側(cè)；(1)與左側(cè)相比，P<0.05。圖3 大鼠左、右側(cè)黑質(zhì)細胞核中Endo-G蛋白的表達Fig.3 Expression of Endo-G protein in nucleus in the different groups

表1 左、右側(cè)黑質(zhì)線粒體和黑質(zhì)細胞核中Endo-G表達量的變化Tab.1 Comparison of Endo-G protein expression in mitochondria and nuclei in two

2.3 Endo-G核轉(zhuǎn)移率

Ctrl組Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞率(5.12±0.89)%低于 PD組(16.99±2.10)%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A為Ctrl組(100×)，箭頭所示為未發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞；B為PD組(100×)，箭頭所示為發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞；A、B右上角白框內(nèi)圖形為箭頭所指區(qū)域的放大圖(400×)；C為Endo-G核轉(zhuǎn)移率；(1)與Ctrl組相比，P<0.05。圖4 兩組大鼠黑質(zhì)細胞中發(fā)生Endo-G核轉(zhuǎn)移細胞的比例Fig.4 Expression of Endo-G detected by IHC staining in two groups

3 討論

PD是由于黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元逐漸變性丟失而造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[12-13]。PD的病因與機制至今未明，研究表明凋亡參與了多巴胺能神經(jīng)元變性丟失的過程[14-15]。凋亡為生理性的細胞清除，與有絲分裂相對應，是由基因控制細胞主動而有序死亡的過程[16-17]。根據(jù)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)家族在凋亡中所起的作用，可將凋亡分Caspase 依賴型凋亡和非Caspase依賴型凋亡。Caspase依賴型凋亡即經(jīng)典的細胞凋亡，非Caspase依賴型凋亡無Caspase活化，且不伴有明顯的核染色質(zhì)凝聚[18-20]。

Endo-G是一種Mg2+依賴的非特異性核酸內(nèi)切酶，由核基因編碼，在細胞質(zhì)中翻譯成前體蛋白，隨后轉(zhuǎn)運至線粒體中切割掉N端48個氨基酸變?yōu)槌墒祗w[21-22]。在正常的細胞中，由于區(qū)室化作用，成熟的Endo-G位于線粒體膜間隙，不僅參與到mtDNA的修復和重組，而且還是細胞增殖所必需的，缺乏Endo-G的細胞將停滯在G2期，無法進入M期[23-24]。嚴重的氧化應激、細胞內(nèi)的鈣超載以及缺血過程中能夠誘導Endo G自線粒體中釋放到胞漿中，并隨即轉(zhuǎn)位至胞核中，導致核小體DNA碎片，介導非Caspase依賴型凋亡[25-26]。TH是將酪氨酸催化為多巴胺前體多巴的酶，特異性的存在于多巴胺能神經(jīng)元中。因此，TH的免疫組化染色可以反映出多巴胺能神經(jīng)元的損傷狀況[11]。

本實驗采用立體定位技術(shù)向健康雄性SD大鼠右側(cè)紋狀體內(nèi)注射6-OHDA誘導建立單側(cè)損毀PD大鼠模型，通過蛋白印記和免疫組化檢測Endo-G在黑質(zhì)區(qū)的表達和分布的情況，探討Endo-G介導的非Caspases依賴性凋亡通路在PD發(fā)生發(fā)展過程中的作用。與假手術(shù)對照組相比，6-OHDA誘導損傷建立的單側(cè)損毀PD模型大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)線粒體中Endo-G含量顯著下降，而細胞核中Endo-G含量顯著升高；且免疫組化結(jié)果顯示，在PD模型大鼠損傷側(cè)黑質(zhì)區(qū)域，Endo-G除分布于胞漿外，在細胞核也有大量分布。這些結(jié)果表明，在6-OHDA誘導的PD大鼠模型黑質(zhì)中，Endo-G從線粒體轉(zhuǎn)為至細胞核中，介導非Caspases依賴性凋亡。