光棘球海膽seali基因克隆及表達特性分析

王 錦 張 健 劉炳正 張偉杰 常亞青 孫志惠

(大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室, 大連 116023)

PIWI (P-element induced wimpy testis)作為一種調控蛋白, 在干細胞維持、生殖細胞發育及體細胞基因調控中發揮重要的作用[1]。PIWI蛋白最早在果蠅(Drosophilidae)生殖干細胞中被鑒定, 是Argonaute蛋白家族的一個亞家族, 具有PIWI和PAZ兩個進化上高度保守的結構域[2]。PIWI亞家族蛋白廣泛存在于多種物種。在果蠅中,piwi在卵巢、精巢和體細胞中均有表達, 缺失piwi, 原始生殖細胞(Primordial germ cell, PGC)的自我更新能力將受到影響, 體細胞中過表達piwi導致生殖細胞數量增加[3,4]。在斑馬魚(Danio rerio)中,piwi(ziwi)基因在生殖細胞中特異表達, 且在卵巢和精巢中都有表達,與生殖細胞維持和斑馬魚的性別決定有關[5,6]。在小鼠(Mus musculus)中,Piwi在精母細胞和精子細胞中特異表達, 是精子發生所必需的, 而小鼠的另一Piwi同源基因Mili在卵母細胞中也有表達[7,8]。

在紫色球海膽(Strongylocentrotus purpuratus)中, 已鑒定出兩種Piwi同源蛋白, Seawi和Piwi like 1(也有稱Seali), 其中Piwi的表達模式與Vasa非常相似, 均在早期胚胎中呈泛表達狀態[9,10]。紫色球海膽seawi基因在胚泡形成過程中募集, 隨后在囊胚期的植物板處局部富集, 原腸期時遷移至腸系膜頂端, 最后合并到棱柱幼蟲的兩個體腔袋中并于左側富集, 由此推測seawi基因可能在紫色球海膽生殖細胞發育過程中發揮重要作用[11]。在成體紫色球海膽中,seawi于成熟卵巢的卵母細胞均勻分布; 在綠海膽(Lytechinus variegatus)和紅海膽(Mesocentrotus franciscanus)中,seawi在各組織中均有表達[9,10]。在海膽中, 針對piwi相關的研究多集中在胚胎發育時期, 成體水平的相關研究較少, 而光棘球海膽中piwi相關基因的表達情況尚不清晰。

光棘球海膽(Mesocentrotus nudus), 又稱大連紫海膽, 屬棘皮動物門, 海膽綱, 主要分布于遼東半島和黃、渤海域。其性腺營養豐富、品質優良, 是我國北方沿海主要的經濟種類和出口海產品之一[12]。本研究以光棘球海膽為研究對象, 克隆獲得了光棘球海膽Mnseali基因的全長cDNA序列, 并利用熒光定量PCR技術檢測了其在成體組織中的表達情況,并由胚胎發育時期持續檢測至性成熟時性腺中的表達動態變化。此外, 通過切片原位雜交技術對Mnseali基因在性腺中細胞定位進行分析。本研究為進一步探究Mnseali在海膽生殖細胞發育中發揮的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用光棘球海膽, 捕撈于大連市黑石礁海域(121°33′47′′E, 38°51′55′′N)。實驗前, 所用海膽在大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室的循環水槽中暫養一周, 培養條件為: pH 為7.96±0.02; 海水溫度為(12.41±0.11)℃; 鹽度為(30.13±0.21)‰。每天投喂一次海帶及石莼等常見藻類植物, 每兩天更換一次海水。

1.2 方法

總RNA的提取及cDNA的合成在解剖海膽后, 所取樣品立即置于液氮中速凍, 備用。總RNA的提取參照SV Tolal RNA Isolation System(Promaga Z3100)說明書進行。利用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測RNA質量。隨后, 取1 μg卵巢組織總RNA, 參照SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 634923)建立卵巢cDNA文庫。將總RNA反轉錄為cDNA的合成則參照PrimeScriptTMRTreagentKit(TaKaRa634860)說明書進行。

cDNA全長克隆在前面研究中, 我們獲得了光棘球海膽性腺轉錄組數據庫[13]。在本研究中,我們以人PIWI蛋白序列為比對序列, 在光棘球海膽性腺轉錄組數據庫中搜索到了Mnseali的基因片段。根據所得到的基因片段, 使用PrimerPremier 5.0軟件設計5′和3′RACE引物(表1), 參照SMARTer?RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 634923)說明書克隆其cDNA全長序列。PCR擴增使用LATaq酶(TaKaRa RR02MA), PCR程序如下: 94℃預變性5min; 94℃, 30s; 62℃, 30s; 72℃, 1.15min; 30個循環;72℃延伸10min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后, 切膠純化回收DNA, 并將純化的DNA連接pMD18-TV載體, 轉化到Trans1-T1感受態細胞中,在LB培養基上涂布后于37℃培養箱中過夜。第二天挑取單菌落于裝有LB液體培養基的離心管中,震蕩培養, 然后通過菌落PCR篩選陽性克隆并測序。

seali序列及系統進化分析利用NCBI中ORF-Finder預測Mnseali基因的開放閱讀框; 分別使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)及Ex-Pasy中的Protparam工具(https://web.expasy.org/protparam/)預測MnSeali蛋白的結構域和基本理化性質;分別采用Predict(Proteinhttps://www.predictpro tein.org/)、Swiss-model(https://swissmodel.expasy.org/)分析MnSeali蛋白的二級結構和三級結構; 隨后利用Clustal W進行多重序列比對, 并用MEGA7.0對MnSeali進行系統進化分析。

熒光定量PCR驗證基因表達分析使用Light-Cycler?96Instrument(Roche, LightCycler?96)進行熒光定量PCR反應, 反應體系如下: FastStartEssentialDNAGreenMaster 10 μL, 上、下游引物(10 μmol/L)0.8 μL, cDNA 2 μL, H2O 6.4 μL。PCR程序如下:95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 60s; 40個循環; 95℃,10s; 65℃, 60s; 97℃, 1s。以光棘球海膽ubiquitin基因作為內參, 采用2-ΔΔCt方法計算基因的表達情況。利用SPSS21.0軟件對所得熒光定量PCR數據進行ANOVA單因素方差分析, 存在顯著性差異和存在極顯著性差異分別為P＜0.05和P＜0.01。

表1 PCR所用到的引物序列Tab. 1 Sequences of the primers used for PCR

RNA探針合成根據克隆所得到的Mnseali基因cDNA序列, 設計探針引物(表1)。隨后, 參照T7 RNA Polymerase(Roche, 10881767001)和DIG RNA labeling mix(Roche, 11277073910)說明書在體外制備RNA探針, 具體操作如下: PCR擴增得到特異目的片段經切膠純化回收后備用; 在微量離心管中配制總體積為10 μL的反應體系: PCR productor DNA2.5 μL(DNA濃度為400 ng/μL, 保證DNA總量為1 μg)、DIG RNA Labeling mixor 1 μL、Transcaription buffer 1 μL、T7 RNA聚合酶1 μL、RNA酶抑制劑1 μL、RNase-free water 3.5 μL, 充分混勻后于37℃反應2h。在反應完成后, 加入1 μL DNA酶37℃孵育15min, 以便充分消化剩余DNA模板。隨后, 加入2.5 μL Licl和75 μL無水乙醇, 于-20℃沉淀過夜; 翌日, 4℃, 13000 r/min離心15min,之后用75%無水乙醇洗滌兩次; 最后, 用20—30 μL無RNA酶水重懸RNA。

RNA切片原位雜交RNA切片原位雜交參照實驗室前面的實驗方法進行[14], 該實驗主要分為6個部分, 分別為: 樣品的處理,、樣品固定、 雜交、 洗脫、顯色和鏡檢。所用去離子甲酰胺購自AMRESCO(美國), 所用DiethylPyrocarbonate(DEPC)采購于Sigma-Aldrich?(上海), 所用Tween、20×SSC、PBS磷酸緩沖液粉末均采購自索萊寶公司(北京)。具體流程如下:

樣品處理: 將光棘球海膽的性腺組織經4%DEPC處理的Perfluoroalkoxy(DEPC-PFA)4℃固定過夜; 第二天, 用DEPC-PBS搖洗三次, 每次5min;之后用30%蔗糖于4℃滲透過夜; 第三天, 使用組織包埋劑OCT(Tissue-Tek, 上海)進行包埋, 用Leica-CM1900-1-1進行冷凍切片; 切片后, 將玻片于37℃烘箱中烘烤1h。

樣品固定: 將烘干的玻片置于裝滿DEPC處理的PBS(DEPC-PBS)的臥式染缸中, 室溫搖洗2次, 每次5min; 用4% DEPC-PFA固定載玻片上的組織樣品; 用DEPC-PBS, 室溫搖洗2次, 每次5min, 洗去多余的固定液。

雜交: 在每個濕盒上放置三張濾紙, 用濕盒緩沖液(20×SSC 2.5 mL; DEPC水22.5 mL; 去離子甲酰胺25 mL)充分浸透; 每張切片加100—200 μL雜交液(探針含量1 μg/mL), 蓋上蓋玻片; 用封口膜將濕盒密封, 置于59℃烘箱雜交18—20h。

洗脫: 將玻片置于裝滿63℃預熱洗脫液(20×SSC 12.5 mL; 去離子甲酰胺125 mL; Tween 0.25 mL; DEPC水112.5 mL)的臥式染缸中, 63℃搖洗2次, 每次30min; 之后用0.2×SSC于63℃搖洗2次,每次30min; 馬來酸于室溫搖洗兩次, 每次20min; 接著, 用封阻液(10%羊血清+馬來酸)室溫封阻1h; 隨后, 加抗體于4℃條件下孵育過夜。

顯色和鏡檢: 用馬來酸在室溫中搖洗三次, 每次20min; 堿性磷酸酶顯色緩沖液, 室溫搖洗三次,每次5min; 隨后按照說明配置堿性磷酸酶顯色液(碧云天, C3206), 避光顯色; 顯色完成后于裝滿PBS的臥式染缸中, 室溫搖洗2次, 每次5min, 并進行甲醇梯度脫色; 脫色完成后用甘油封片, 并使用Leica DM4B進行鏡檢拍照。

2 結果

2.1 Mnseali基因cDNA全長序列分析

本研究克隆得到Mnseali基因的cDNA全長序列(GenBank登錄號: MK775490), 該序列全長3462 bp,其中3′UTR長度為416 bp, 5′UTR為180 bp, 其中3′UTR的加尾信號并非經典的AAUAAA或AUUAAA,而是較少見的AAUACA[15,16]。開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)長度為2862 bp, 起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TGA)分別位于181 bp處和3040 bp處, 共編碼954個氨基酸。結構域預測結果表明,MnSeali蛋白具有兩個進化上高度保守的結構域: PAZ(Arg385-Arg50)和Piwi(Arg493-Gln936) (圖1A)。此外,Mnseali蛋白的理論分子量為107.13 kD, 理論等電點為9.43。MnSeali蛋白質的二級結構中α-螺旋(alpha-helix, H)、延伸鏈(strand, E)和無規則卷曲(coil, L)占比分別約為22.14%、20.78%和57.08%,其不穩定系數為48.26, 蛋白質歸類為不穩定蛋白質。MnSeali蛋白質中有酸性氨基酸殘基89個, 堿性氨基酸殘基120個, 其親水平均值(GRAVY)值為-0.413, 為親水性蛋白(圖1)。以已知三維結構的沙蠶(Sipunculus nudusLinne)的Piwi蛋白(Swiss-model模板號: 5 guh.1.A)為模板, 進行同源建模, 得到MnSeali的氨基酸序列與沙蠶Piwi氨基酸序列的一致性為38.37%。MnSeali氨基酸序列中含有多個疏水區域, 共有295個疏水殘基, 其數量遠小于親水殘基, 即該蛋白為親水性蛋白, 與蛋白理化性質預測結果一致。另外,MnSeali蛋白中沒有跨膜螺旋區,意味著該蛋白不是膜蛋白。此外,MnSeali蛋白含有三個糖基化位點, 分別位于Asn324-Thr326、Asn366-Ser368和Asn405-Thr408(圖1B-C)[17]。

2.2 多重序列比對和系統進化分析

我們從NCBI下載了其他物種與Seali同源的蛋白質序列, 使用Clustal W進行多重序列比對。比對結果顯示,MnSeali的蛋白質序列與紫色球海膽seali基因編碼的蛋白質序列相似度最高, 其一致性為92.41%, 而與紫色球海膽seawi基因編碼的蛋白質序列相似度較低, 一致性為36.47%。與其他棘皮動物的蛋白質序列也展示了較高的一致性, 譬如:與仿刺參(Apostichopus japonicus)Seali的一致性為50.83%, 與海星(Asterias rubens)Piwi-1和Piwi-2的一致性分別為40.31%和54.87%。但是與脊椎動物如斑馬魚和人的PIWI則展現出較低的同源性, 其一致性分別為39.12%和37.96%。但是, 其PIWI結構域, 無論是在脊椎動物還是在棘皮動物中均展現出較為穩定的一致性(46.22%—65.55%)。基于多重序列比對結果, 利用MEGA7構建了neighbor-joining(NJ)系統進化樹, 如圖2所示: 光棘球海膽Seali蛋白先與同屬棘皮動物門的紫色球海膽Seali蛋白聚類, 之后與海星的Piwi-2蛋白聚類, 再與紫色球海膽的Seawi蛋白和海星的Piwi-1蛋白聚類,說明Seali/Piwi-2蛋白和Seawi/Piwi-1蛋白應是同屬PIWI亞家族蛋白的兩種不同基因, 其聚類結果與物種親緣關系基本一致。

2.3 Mnseali組織表達特異性分析

如圖3所示, 在光棘球海膽的性腺、腸、體腔細胞和管足四種組織中均檢測到了seali轉錄本。Mnseali在性腺中表達量最高, 且在精巢和卵巢中呈現差異表達, 在卵巢中表達量是精巢中表達量的1.95倍, 所用海膽性腺均為生長期(Stage Ⅱ)。在其他成體組織中也有表達, 其相對表達量從高到低依次為: 體腔細胞＞管足＞腸。

2.4 Mnseali在不同性腺發育時期的動態表達分析

考慮到Mnseali在性腺中表達量最高, 通過持續取樣, 我們獲得了處于不同性腺發育時期的性腺樣品: 恢復期(Stage Ⅰ)、生長期(Stage Ⅱ)、成熟前期(Stage Ⅲ)和成熟期(Stage Ⅳ)。隨后利用熒光定量PCR檢測Mnseali在性腺發育過程中的動態表達情況。如圖4所示, 隨卵母細胞的成熟,Mnseali基因的表達量逐漸升高, 在成熟期卵巢中其表達量達到峰值。而在雄性個體中, 處于恢復期、生長期及成熟前期的精巢中Mnseali基因的表達量并無顯著變化, 而到了成熟期, 其表達量顯著上調, 是恢復期表達量的2.05倍。

隨后, 我們進一步通過RNA切片原位雜交技術分析Mnseali基因在性腺中細胞定位, 如圖5所示,在卵巢,Mnseali在不同發育時期的雌性生殖細胞中均有表達。精巢中,Mnseali在除了成熟精子外的雄性生殖細胞中均有表達, 在營養細胞中未檢測到Mnseali陽性信號, 且其表達情況與熒光定量結果相似。

圖1 MnSeali蛋白結構域預測及其蛋白質三級結構預測Fig. 1 Prediction of the MnSeali protein domain and protein tertiary structure

圖2 MnSeali系統進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of MnSeali

2.5 Mnseali在胚胎發育時期及早期個體發育時期的表達水平分析

如圖6所示,Mnseali基因為母源因子, 在未受精卵中即檢測到了Mnseali轉錄本, 在四胞、囊胚、棱柱幼蟲、四腕、六腕及八腕幼體中可持續檢測到轉錄本, 且逐漸降低, 此結果與之前報道的紫色球海膽胚胎發育時期piwi基因表達量的變化趨勢大致吻合。

圖3 Mnseali組織表達特異性分析(以精巢為參照)Fig. 3 Mnseali expression in adult tissues (Relative fold to testis)

圖4 Mnseali在不同性腺發育時期的動態表達分析(以恢復期為參照)Fig. 4 Dynamic expression analysis of Mnseali in different stages of gonadal (Relative fold to stage Ⅰ)

圖5 切片原位雜交分析Mnseali在不同發育時期性腺中的表達情況Fig. 5 SISH analyses of Mnseali transcripts at different stages of gonadal

圖6 Mnseali在胚胎發育時期的表達分析(以受精卵為參照)Fig. 6 Expression analysis of Mnseali in embryonic samples(Relative fold to egg)

3 討論

本研究利用同源性克隆和cDNA末端快速擴增首次獲得光棘球海膽Mnseali基因的全長cDNA序列, 該序列共編碼954個氨基酸。經氨基酸序列多重比對分析, 不同物種間Seali氨基酸序列的差異較大, 其一致性為37.96%—92.41%。但是其PIWI結構域在不同物種間的一致性差異并不大(46.22%—65.55%), 這與之前報道的研究結果基本一致[2]。此外,Mnseali和紫色球海膽seali基因的氨基酸序列相似度極高, 其一致性高達92.41%, 且系統進化分析結果表明, 光棘球海膽seali基因與紫色球海膽seali基因聚為一支, 以上結果表明seali基因的進化符合光棘球球海膽的進化和分類地位。

在光棘球海膽中,seali不僅在性腺組織的生殖細胞中表達, 還在其他成體組織, 如體腔液、管足、腸中也有表達, 這種表達模式與產自大西洋西部的綠海膽(L. variegatus)表達情況相似[10]。在紫色球海膽中,seali也呈廣泛表達狀態[18]。但是, 在其他大多數脊椎動物中, 如非洲爪蟾(Xenopus)、斑馬魚、小鼠中,piwi均在生殖細胞中特異表達[5—8,19]。海膽中seali這種特殊的表達模式意味著seali可能在進化的過程中發生了功能歧化, 其除海膽生殖細胞發育過程中發揮作用外, 可能還有其他尚不明確的生物學功能。

與脊椎動物中一樣,Mnseali為母源因子, 在囊胚期以前的胚胎中均可以檢測到大量的轉錄本。隨著胚胎發育的進行,Mnseali持續表達。無論是在精巢還是在卵巢中,seali均在生殖細胞中特異表達,這一結果與絕大多數物種piwimRNA在生殖細胞中特異表達一致。在雌性光棘球海膽個體中, 隨著卵母細胞的成熟seali基因表達量逐步上調, 這暗示著seali可能和光棘球海膽卵母細胞的成熟有關。在成熟期精巢中seali的表達量上調, 推測在光棘球海膽中seali可能與精子的發生相關[21,22]。因此,Mnseali有望作為光棘球海膽生殖細胞標記因子, 追蹤光棘球海膽生殖細胞的起源、遷移以及性腺的分化, 為海膽生殖細胞發育相關的研究提供了支撐。