HPLC法研究布洛芬混懸液在大鼠體內的藥動學*

胡 洋，楊 奕，楊子毅

(江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122)

發熱是兒童臨床上的常見病和多發病。據報道，發熱病人中，兒童患者占50%，發熱患兒占兒科醫生患者的30%[1-2]，若不及時治療，易引起患兒高熱驚厥，增加呼吸負擔，甚至發生生命危險。布洛芬是一種抗炎、鎮痛和解熱作用的非甾體抗炎藥，廣泛用于治療發燒和輕度至中度疼痛，是推薦使用療效明確、安全性高的兒童退燒藥[3]。作用機制是通過抑制環氧化酶起作用，減少前列腺素的合成，使下丘腦體溫調節中樞異常升高的體溫調定點恢復到正常水平而產生退熱作用。這類藥物只能使發熱者的體溫下降，而對正常體溫沒有影響[4-5]。

國內市場布洛芬劑型包括片劑、膠囊、混懸滴劑[6]，各產品臨床治療效果低效同質化現象嚴重，部分制劑物理穩定性較差，且國內尚無通過一致性評價的兒童用布洛芬制劑。國外布洛芬兒童用口服制劑發展相對成熟，其中，強生公司的布洛芬混懸液“美林(Motrin?)”療效明確且市場反饋良好。因此，有必要研究美林在大鼠體內藥代動力學，以期對國內兒童用布洛芬制劑的開發提供參考。本研究通過灌胃給予大鼠同等劑量美林，并建立專屬性強，靈敏度和準確度高的高效液相色譜法測定布洛芬血藥濃度，考察美林體內藥代動力學特征。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

KQ-200KDE型高功率數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHK-Ⅲ 循環水式多用真空泵，鄭州科泰實驗設備有限公司；Centrifuge 5424R高速冷凍離心機，德國Eppdndorf公司；Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；移液槍，DRAGONLAB公司；氮吹儀，上海那艾精密儀器有限公司；旋渦混合器，無錫沃信儀器制造有限公司；毛細管，南京金留化玻儀器有限責任公司；灌胃針，深圳市恒銘金屬制品有限公司；注射器，江蘇恒康醫療器械有限公司；空氣壓縮泵，臺州市奧突斯工貿有限公司。

美林，上海強生制藥有限公司；布洛芬，山東新華制藥股份有限公司；吲哚美辛，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲基叔丁基醚(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；肝素鈉，國藥集團化學試劑有限公司；乙腈(HPLC)，美國TEDIA公司；磷酸(AR)，國藥集團化學試劑有限公司；磷酸二氫鉀，國藥集團化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠36只，重量約為190～210 g，購買于昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司。實驗倫理審核編號為JN.No20181115S0181225[245]。

1.3 實驗方法

1.3.1 給藥方案與血漿樣品采集

給藥方案：根據兒童布洛芬混懸液Motrin?臨床給藥劑量，確定兒童劑量為6 mg/kg，折算成大鼠給藥劑量為37.5 mg/kg(以布洛芬計)，采用灌胃方式給藥，給藥前12 h禁食不禁水。根據大鼠實際體重給藥，給藥前稱重并標號。

血漿樣品采集：給藥后5 min、10 min、20 min、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h時，使用毛細管于眼底靜脈叢取血約0.3 mL，置于預先肝素化的1.5 mL尖底離心管中，4000 rpm離心10 min，移取上層血漿于未肝素化離心管中，置于-4 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 血漿樣品的處理

內標溶液的配制：精密稱取吲哚美辛0.04 g置于100 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解，冷卻至室溫后，用甲醇定容至刻度線。用移液管吸取1 mL上述溶液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，即得濃度為40 μg/mL的內標溶液。

血漿樣品的處理：取內標溶液(40 μg/mL 吲哚美辛)、布洛芬溶液20 μL加入10 mL離心管中，并加入100 μL血漿樣品，渦旋1 min混勻；加入酸化試劑(0.2 mol/L鹽酸)100 μL，渦旋2 min；再加入3 mL甲基叔丁基醚，渦旋10 min；4000 rpm離心10 min后，取上清液2.5 mL至5 mL離心管，使用氮吹儀在40 ℃下吹干；加入200 μL 70%甲醇-水復溶，渦旋5 min后12000 rpm離心10 min，取上清液100 μL進樣，采用高效液相色譜儀測定血藥濃度。

1.3.3 布洛芬體內分析方法學考察

(1)色譜條件

采用高效液相色譜法(HPLC)測定布洛芬血藥濃度。色譜條件：Agilent?C18UPLC Proshell色譜柱(4.6×50 mm，2.7 μm)；流速：0.8 mL/min；進樣體積：10 μL；檢測波長: 220 nm；柱溫：40 ℃。流動相：磷酸二氫鉀(88 mmol/L，pH 2.5):乙腈=50:50(V/V)。

(2)專屬性實驗

按照血漿樣品處理方法，分別處理空白血漿、含藥血漿、含內標血漿樣品，在選定的色譜條件下，分別進樣，記錄色譜圖。

(3)線性和定量限實驗

線性：分別配制濃度為4 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL的布洛芬溶液，按照血漿樣品處理方法處理生物樣品。并按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。

定量限：加入不同濃度布洛芬溶液，處理血漿樣品，按“2.3.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算信噪比。信噪比等于10時，血藥濃度為定量下限。

(4)精密度與準確度實驗

分別配制濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、400 μg/mL的布洛芬溶液，按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，配制為高、中、低三個濃度質控(QC)樣品，血藥濃度分別為QC-L：2 μg/mL、QC-M：10 μg/mL、QC-H：80 μg/mL，每個濃度QC樣品平行處理三份，按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，計算精密度與準確度。

(5)提取回收率實驗

分別配制濃度為10 μg/mL、100 μg/mL、500 μg/mL的布洛芬溶液，按血漿樣品處理方法處理生物樣品，配制不同血藥濃度的血漿樣品，分別為高(100 μg/mL)、中(20 μg/mL)、低(2 μg/mL)三個血藥濃度，每個濃度樣品平行處理三份，按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，此時藥物峰面積記為A1，內標峰面積記為B1。

按照血漿樣品處方方法處理生物樣品，內標溶液(40 μg/mL)在加入甲基叔丁基醚并離心后，再加入。按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，此時藥物峰面積記為A2，內標峰面積記為B2。

藥物提取回收率=A1/A2×100%

內標提取回收率=B1/B2×100%

(6)穩定性試驗

酸化穩定性：按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，加入酸化試劑(0.2 mol/L鹽酸)后，分別于0 h、2 h、4 h加入甲基叔丁基醚，再進行渦旋、離心、吹干和復溶。按“2.3.1”項下操作進樣，記錄色譜圖，測定不同時間血藥濃度，計算RSD。

復溶穩定性：按照血漿樣品處理方法處理生物樣品，將復溶樣品分別于復溶后0 h、4 h、8 h、12 h進樣，記錄色譜圖，測定不同時間血藥濃度，計算RSD。

1.3.4 體內藥代動力學分析

根據大鼠灌藥后各時間點所測得的實際血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，并用藥動學軟件DAS 3.2.8軟件計算主要藥動學參數，評價兒童用布洛芬混懸液美林得體內藥動學特征。

2 結果與討論

2.1 體內分析方法學的建立

2.1.1 專屬性

按“1.2.3(2)”項下操作，色譜圖如圖1所示。內標峰與藥物峰分離度>1.5，保留時間分別為7.0 min、7.7 min，與空白血漿內源性物質互不干擾。符合生物樣品測定要求。

圖1 專屬性色譜圖Fig.1 Specific chromatogram

2.1.2 線性與定量限

按“1.2.3(3)”項下操作，計算體內分析方法線性范圍。以布洛芬血藥濃度為橫坐標，布洛芬與內標(40 μg/mL 吲哚美辛)峰面積比值為縱坐標，用加權(1/X2)最小二乘法進行計算，得到標準曲線方程。經計算得到血漿中IBU標準曲線方程分別為Y1=0.0508X1+0.0030，R2=0.9996；Y2=0.0577X2+0.0094，R2=0.9987；Y3=0.0618X3-0.0012，R2=0.9998，標準曲線中R2>0.99，符合要求，故IBU血藥濃度線性范圍為0.8～100 μg/mL。

按“1.2.3(3)”項下操作，測得IBU血藥濃度定量下限(LLOQ)為0.8 μg/mL。

2.1.3 精密度與準確度

按“1.2.3(4)”項下操作，計算質控樣品低(QC-L)、中(QC-M)、高(QC-H)濃度樣品準確度與精密度。結果顯示，QC-L、QC-M、QC-H精密度(RSD)分別為5.37%、7.83%、3.36%，均小于15%；準確度分別為111.56%～119.14%、86.45%～100.25%、99.44%～103.67%，QC-L樣品測定結果在80%～120%范圍內，QC-M與QC-H樣品測定結果在85%～115%范圍內，符合質量標準，表明體內分析方法的精密度與準確度符合要求。

2.1.4 提取回收率

按“1.2.3(5)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算提取回收率。結果顯示，布洛芬在低、中、高三個濃度下提取回收率為59.87%±17.71%、71.60%±9.45%、82.02%±6.57%，對應內標提取回收率為52.46%±9.69%、56.57±8.28%、54.73%±5.39%。布洛芬與內標提取回收率>50%，符合要求，表明甲基叔丁基醚可以用作提取溶劑。

2.1.5 穩定性

酸化穩定性：按“1.2.3(6)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算血藥濃度。結果顯示，0 h、2 h、4 h血藥濃度分別為21.30 μg/mL、19.72 μg/mL、20.92 μg/mL，與0 h相比，準確度分別為92.58%、98.22%，血藥濃度較穩定，符合要求。

復溶穩定性：按“1.2.3(6)”項下操作處理樣品，并進樣、記錄色譜圖，計算血藥濃度。結果顯示，0 h、4 h、8 h、12 h血藥濃度分別為21.30 μg/mL、20.71 μg/mL、19.09 μg/mL、22.07 μg/mL，與0 h相比，準確度分別為97.23%、89.62%、103.62%，血藥濃度較穩定，符合要求。

2.2 藥動學數據分析

按“1.2.1”項下方案給藥，并按“1.2.3(1)”項下操作測定大鼠體內不同時刻血藥濃度，血藥濃度-時間數據如表1所示，藥時曲線如圖2所示。

表1 美林灌胃后大鼠各時血藥濃度Table 1 Blood concentrations of rats at various times after intragastric administration of Motrin?

圖2 大鼠灌胃后制劑的平均血藥濃度-時間曲線(Mean±SD，n=6)Fig.2 Mean plasma concentration-time curve of preparations after intragastric administration in rats (Mean ± SD, n=6)

由表1可看出制劑進入大鼠體內的吸收行為存在個體間差異，Rat-3和Rat-4整體血藥濃度偏低。圖2可看出平均血藥濃度隨著時間變化的趨勢，表明藥物在1 h左右達到最大血藥濃度(43.98±16.49)μg/mL，藥物在胃中快速釋放并吸收。此外，對于口服Motrin?混懸液的動物組，樣品血藥濃度數據大多數均在分析方法的LLOQ之上，極少數QC樣品不合格，表明測定血藥濃度數據準確反映出體內真實血藥濃度。時間-血藥濃度數據經DAS 3.2.8軟件處理，主要藥動學參數如表2所示。

由表2可知，Tmax為(1.21±0.64)h，表明制劑在體內迅速釋放并吸收；最大血藥濃度為(49.53±15.29)μg/mL，藥物半衰期為(4.51±3.20)h，0～t時間，進入人體內藥物量為(343.49±96.16)μg/mL·h-1，0～∞時間，藥物進入人體量為(352.37±87.28)μg/mL·h-1，表明藥物在較短時間內達到最大血藥濃度并吸收，起效快，藥效維持時間長。

3 結 論

本研究發現，在酸性條件下，布洛芬和吲哚美辛HPLC圖譜表現出較好的峰形，主藥峰、內標峰和血漿內源性物質峰分離度好。布洛芬在血藥濃度0.8～100 μg/mL范圍內呈良好的線性關系，精密度、準確度、提取回收率和穩定性均符合要求。美林藥動學參數數據表明，制劑進入體內，個體間存在吸收差異。對6只大鼠時間-血藥濃度數據進行統計學分析，Tmax、Cmax分別為(1.21±0.64)h、(49.53±15.29)μg/mL，AUC0-t和AUC0-∞分別為(343.49±96.16)μg/mL·h-1、(352.37±87.28)μg/mL·h-1，表明制劑進入體內能夠較快地發揮藥效、更長時間地維持較高的血藥濃度。從臨床需要來看，美林在大鼠體內藥代動力學的初步研究可為國內兒童用布洛芬制劑的開發提供參考。