長鏈非編碼RNA牛磺酸上調(diào)基因1表達水平在Ⅰ～Ⅱ期宮頸癌診斷和預(yù)后中的作用

夏 艷，金志軍

宮頸癌(cervical cancer, CC)是全球女性第三大常見腫瘤[1]。目前CC的治療方法有外科手術(shù)、化療和放療等，但是由于腫瘤細(xì)胞耐藥、疾病復(fù)發(fā)等，患者的預(yù)后欠佳，5年生存率約為40%[2-3]。因此，開發(fā)新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物以提高患者長期生存獲益是非常必要的。長鏈非編碼RNAs (long non-coding RNAs, lncRNAs)是一類長度>200個核苷酸、不具有編碼蛋白質(zhì)功能的RNA分子[4]，其在多種疾病中發(fā)揮重要功能，包括表觀遺傳調(diào)控和轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等[5]。最近，越來越多的研究表明，lncRNA表達失調(diào)與腫瘤的發(fā)生和進展有關(guān)[6-10]。在所有與癌癥相關(guān)的lncRNAs中，牛磺酸上調(diào)基因1(taurine upregulated gene 1, TUG1)是近年發(fā)現(xiàn)的lncRNA，它參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡[6-7,11-14]。lncRNA TUG1在膽管癌、乳腺癌、膀胱癌等多種腫瘤組織中高表達，并且與患者的預(yù)后相關(guān)[7,15-16]。本研究旨在評估CC患者癌組織lncRNA TUG1的表達水平與CC診斷及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1對象 前瞻性隊列研究連續(xù)納入2014年1月—2015年12月接受手術(shù)治療的CC患者137例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)臨床和病理檢查確診為CC患者；(2)年齡≥18周歲；(3)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(international federation of gynecology and obstetrics, FIGO)分期為Ⅰ～Ⅱ期；(4)準(zhǔn)備接受手術(shù)切除，且未行術(shù)前新輔助化療或放療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)嚴(yán)重感染或中重度肝腎功能異常患者；(2)有性傳播疾病或急性生殖系統(tǒng)炎癥患者；(3)有其他惡性腫瘤史患者；(4)妊娠期或者哺乳期婦女；(5)研究者評估難以定期隨訪的患者。本研究已獲得第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

1.2信息采集和隨訪 137例確診為CC的患者中，年齡<45歲44例(32.1%)，年齡≥45歲93例(67.9%)；腫瘤大小<4 cm 59例(43.1%)，≥4 cm 78例(56.9%)；組織學(xué)類型為鱗癌的患者82例(59.9%)，腺癌55例(40.1%)。FIGO分期為ⅠA期、ⅠB期和ⅡA期的患者分別為27例(19.7%)，73例(53.3%)和37例(27.0%)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性和陽性分別為69例(50.4%)和68例(49.6%)；宮頸基層浸潤深度<2/3和≥2/3的患者分別為70例(51.1%)和67例(48.9%)。FIGO分期由2名副高以上職稱的婦科醫(yī)師評定。18例行筋膜外子宮切除術(shù)，9例行改良根治性子宮切除術(shù)，110例行根治性子宮切除術(shù)。62例淋巴結(jié)陰性、切緣陰性、宮旁組織陰性，術(shù)后定期詢問病史和體檢，未進行輔助治療；75例手術(shù)發(fā)現(xiàn)盆腔淋巴結(jié)陽性和(或)手術(shù)切緣陽性和(或)宮旁組織陽性，術(shù)后28例進行盆腔放療、31例行盆腔放療+順鉑單藥同步化療、16例行盆腔放療+順鉑聯(lián)合5-氟尿嘧啶的同步化療。手術(shù)后根據(jù)患者年齡、病理類型和分期等因素綜合考慮選擇基于順鉑的同步放化療。術(shù)后第1年，每1～3月隨訪1次，隨后每3～9月隨訪1次，隨訪截止日期為2017年6月，中位隨訪時間為23月(7～42月)。截止2017年6月，137例中共有83例死亡，其中78例因?qū)m頸癌死亡，5例因其他原因死亡。137例中共有59例為終檢值(包括5例因其他原因?qū)е碌乃劳龌颊吆?4例隨訪截止時仍未死亡的患者)。總體生存期(overall survival，OS)定義為患者從診斷之日到任何原因?qū)е滤劳龅臅r間。

1.3標(biāo)本采集 所有患者于手術(shù)中切除宮頸癌組織，并于距癌組織邊緣2.5 cm處取配對的癌旁組織，立即以生理鹽水沖洗，后放入液氮中儲藏，以備后期檢測使用。

1.4定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 采用TRizol法(美國Invitrogen公司)提取CC患者癌組織和癌旁組織的總RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 待用。以U6作為lncRNA TUG1內(nèi)參，嚴(yán)格按照SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR試劑盒(美國KAPA公司)操作說明進行qPCR反應(yīng)(95 ℃ 5 min→40個循環(huán)95 ℃ 5 s→60 ℃ 30 s)，采用2-△△ct方法計算lncRNA TUG1的相對表達量。 lncRNA TUG1和U6引物采用Primer Premier 5.0 (Premier, Framingham, USA)設(shè)計。引物信息如下：

lncRNA TUG1:

Forward：5’-TAGGAGTGGATGTGTTCTGTAGCA-3’

Reverse：5’-TGGTCGTGGAATATGGTCAATGAG-3’

U6：

Forward：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’

Reverse：5’-CTCGCTTCGGCAGCACATA-3’

1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件和GraphPad prism 5.01軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)展現(xiàn)形式為頻率(百分比)或中位值(1/4～3/4分位值)。采用Wilcoxon符號秩和檢驗比較lncRNA TUG1在癌組織和配對的癌旁組織中的表達差異，采用Wilcoxon秩和檢驗比較不同亞組間lncRNA TUGI的表達差異。采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗分析lncRNA TUG1表達水平和OS的關(guān)聯(lián)。采用單元、多元Cox比例風(fēng)險模型分析CC患者的癌組織lncRNA TUG1表達量以及臨床病理特征對患者OS的預(yù)測作用。P<0.05為差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1lncRNA TUG1在CC癌組織和配對的癌旁組織中的表達水平 CC癌組織lncRNA TUG1相對表達量[中位值：2.436(四分位間距：1.278～4.243)]顯著高于配對的癌旁組織[中位值：1.197(四分位間距：0.516～1.947)](P<0.001，圖1)。

2.2癌組織lncRNA TUG1表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián) 采用Wilcoxon秩和檢驗分析癌組織lncRNA TUG1表達水平在CC患者不同臨床病理特征亞組中的差異，結(jié)果顯示癌組織lncRNA TUG1表達水平與FIGO分期(P=0.023)呈正相關(guān)，而與其他臨床病理特征無關(guān)(表1)。

2.3癌組織lncRNA TUG1表達水平與CC患者OS的關(guān)聯(lián) 按照lncRNA TUG1在癌組織中表達水平的中位值2.436將患者分為高表達組和低表達組。Kaplan-Meier曲線和Log Rank檢驗顯示，癌組織lncRNA TUG1高表達患者的累積OS(OS中位值20.0月，95%CI：16.2～23.8月)顯著低于癌組織lncRNA TUG1低表達的患者(OS中位值36.0月，95%CI：31.0～41.1月)(P<0.001，圖2A)。在78例因CC死亡的患者中，癌組織lncRNA TUG1高表達患者的累積OS(OS中位值22.0月，95%CI：16.0～28.0月)顯著低于癌組織lncRNA TUG1低表達的患者(OS中位值36.0月，95%CI：31.0～41.0月)(P<0.001，圖2B)。

2.4影響OS的因素 采用多元Cox比例風(fēng)險模型分析CC患者的癌組織lncRNA TUG1表達量及

表1 癌組織lncRNA TUG1表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)

Tab 1 Correlation of lncRNA TUG1 expression in tumor tissue and clinicopathological features in CC patients

參 數(shù)癌組織lncRNA TUG1表達水平高表達低表達P值n6968年齡/歲0.128 <4518(40.9)26(59.1) ≥4551(54.8)42(45.2)d腫瘤/cm0.349 <427(45.8)32(54.2) ≥442(53.8)36(46.2)組織學(xué)類型0.250 鱗癌38(46.3)44(53.7) 腺癌31(56.4)24(43.6)FIGO分期0.023 ⅠA期11(40.7)16(59.3) ⅠB期33(45.2)40(54.8) ⅡA期25(67.6)12(32.4)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.200 陰性31(44.9)38(55.1) 陽性38(55.9)30(44.1)宮頸肌層浸潤深度0.348 <2/338(54.3)32(45.7) ≥2/331(46.3)36(53.7)

CC:宮頸癌；lncRNA：長鏈非編碼RNA； TUG1：牛磺酸上調(diào)基因1; FIGO分期:國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期.

臨床病理特征對患者OS的預(yù)測作用，發(fā)現(xiàn)癌組織lncRNA TUG1高表達是CC患者OS較差的獨立預(yù)測因素(P=0.001)。此外，腫瘤≥4 cm(P<0.001)、FIGO Ⅱ期(P<0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性(P<0.001)和宮頸基層浸潤深度≥2/3(P=0.002)也是CC患者OS較差的獨立預(yù)測因素。

表2 影響OS因素多元Cox比例風(fēng)險模型分析

Tab 2 Analysis of factors affecting OS by Cox’s proportional hazard regression

項 目多元Cox比例風(fēng)險模型P值HR95% CI低高癌組織lncRNA TUG1高表達0.001 2.417 1.436 4.067 年齡≥45歲0.164 1.464 0.856 2.504 d腫瘤≥4 cm<0.001 2.491 1.524 4.072 組織學(xué)類型(腺癌vs鱗癌)0.584 0.878 0.551 1.398 FIGO分期(Ⅱ vs Ⅰ)<0.001 2.391 1.469 3.891 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(陽性vs陰性)<0.001 2.607 1.566 4.340 宮頸肌層浸潤深度≥2/30.002 2.175 1.344 3.520 手術(shù)方式 筋膜外全子宮切除術(shù)△---- 改良根治性子宮切除術(shù)0.186 2.067 0.705 6.058 根治性子宮切除術(shù)0.212 1.668 0.747 3.722 輔助治療#(有 vs無)0.547 0.851 0.504 1.438

CC:宮頸癌；lncRNA：長鏈非編碼RNA； TUG1：牛磺酸上調(diào)基因1; FIGO分期: 國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期. △:手術(shù)方式以筋膜外全子宮切除術(shù)為參考，其他手術(shù)方式均與筋膜外全子宮切除術(shù)進行對比. #:輔助治療包括：盆腔放療+順鉑(或順鉑+5-氟尿嘧啶).

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)：(1)CC患者的癌組織lncRNA TUG1表達水平高于配對的癌旁組織；(2)CC癌組織lncRNA TUG1表達水平與FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移正相關(guān)；(3)癌組織lncRNA TUG1高表達的患者具有較差的OS，且lncRNA TUG1高表達是CC患者OS較差的獨立預(yù)測因素。此外，腫瘤≥4 cm、FIGO Ⅱ分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和宮頸基層浸潤深度≥2/3是CC患者OS較差的獨立危險因素。

lncRNA TUG1是一個長約7.1 kb的lncRNA，位于染色體22q12。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1可以促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，且多種腫瘤的lncRNA TUG1的表達水平與臨床病理特征相關(guān)。Wang等發(fā)現(xiàn)，與腎透明細(xì)胞癌的癌旁組織相比，癌組織的lncRNA TUG1表達水平顯著升高，且lncRNA TUG1表達水平與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠端轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)[17]。研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中l(wèi)ncRNA TUG1的表達水平高于癌旁組織，且lncRNA TUG1表達水平與腫瘤大小、TNM分期正相關(guān)[15]。這些研究表明，lncRNA TUG1與腫瘤發(fā)生正相關(guān)，并與疾病進程或臨床病理惡性程度相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，CC癌組織lncRNA TUG1表達水平高于配對的癌旁組織，與上述臨床研究結(jié)果趨勢一致。進一步的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1表達水平與FIGO分期正相關(guān)。這原因可能是lncRNA TUG1可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin或ETM等多條信號通路促進腫瘤細(xì)胞的增殖、遷徙以及侵襲[18-22]。

lncRNA TUG1高表達與患者預(yù)后不良密切相關(guān)。lncRNA TUG1高表達與腎透明細(xì)胞癌患者較短的OS相關(guān)，Cox比例風(fēng)險模型分析顯示，lncRNA TUG1 高表達是腎透明細(xì)胞癌患者較差OS的獨立預(yù)測因素[17]。在高度肌層浸潤性膀胱癌中，lncRNA TUG1高表達與患者較差的OS相關(guān)[21]，且lncRNA TUG1高表達是骨肉瘤患者OS和無進展生存期差的獨立預(yù)測因素[20]。本研究顯示，癌組織lncRNA TUG1高表達是CC患者OS較差的獨立預(yù)測因素，且腫瘤≥4 cm、FIGO Ⅱ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性和宮頸基層浸潤深度≥2/3也是CC患者OS較差的獨立預(yù)測因素，這可能是由于lncRNA TUG1可能通過促進癌細(xì)胞增殖、遷移，抑制細(xì)胞凋亡和通過誘導(dǎo)EMT等促進癌細(xì)胞侵襲，以及可降低患者輔助放療和(或)化療敏感度治療有關(guān)[16,18-22]。

本研究還存在一些局限：(1)樣本量相對較小，導(dǎo)致數(shù)據(jù)缺乏統(tǒng)計效能。因此，未來的研究應(yīng)擴大樣本量以進一步驗證lncRNA TUG1表達水平與CC患者臨床病理及預(yù)后的關(guān)聯(lián)；(2)本研究納入的CC患者僅為FIGO Ⅰ～Ⅱ期，無Ⅲ期及Ⅳ期患者，未能評估lncRNA TUG1表達水平在Ⅲ期、Ⅳ期患者中的預(yù)后作用。由于FIGO Ⅳ期患者手術(shù)比例低，難以獲取腫瘤組織樣本，在一定程度上限制了lncRNA TUG1在FIGO Ⅳ期患者中預(yù)后作用的研究。(3)患者接受的治療方式不同，可能會影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量進而影響患者的生存，今后需進一步細(xì)化患者的入排標(biāo)準(zhǔn)，評估患者術(shù)后的生活質(zhì)量，以排除治療方式對研究結(jié)果的干擾。