不同亞型Smads信號蛋白在慢性支氣管哮喘小鼠肺組織表達的意義

文莎，佘暉，游錦惠，劉雪君

支氣管哮喘是臨床上危害人類健康的重要慢性疾病之一，患病年齡段廣，從嬰幼兒至老年均可發生，與過敏、遺傳、環境等多種因素相關[1]，病情反復發作，慢性持續性發展。Smad蛋白家族的名字來源于同源的秀麗隱桿線蟲Sma蛋白和黑腹果蠅Mad蛋白[2]。Smads家族蛋白是一類重要的胞內細胞信號傳遞分子，可以介導轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)、激活素(activins)、Nodal蛋白和生長分化因子(growth differentiation factors，GDFs)等細胞因子細胞內信號轉導[3]，進一步激活并調控細胞核內基因轉錄，從而對支氣管哮喘及氣道重塑的發生、發展產生重要影響。本研究旨在觀察慢性支氣管哮喘小鼠肺組織內Smads各亞型信號蛋白的表達，探索不同亞型Smads蛋白及其傳導的信號通路在慢性支氣管哮喘小鼠慢性氣道炎癥及氣道重塑過程中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 (1)動物：健康清潔級雌性6～8周齡BALB/C小鼠18只，體質量(19±1)g[上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2013-2018]。(2)主要試劑：卵清白蛋白(ovalbumin，OVA，美國Sigma公司)；氫氧化鋁凝膠(美國Sigma公司)；小鼠Smad 1, 3, 4, 5, 7抗體(美國Abcam公司)；β-actin(美國Servicebio公司)。(3)主要儀器：壓縮型霧化器(PARIBOYN，德國百瑞公司)；光學顯微鏡(YS100型，尼康儀器有限公司)；離心機(D3024R，美國DragonLab公司)；組織切片掃描儀及分析軟件(Pannoramic MIDI,Quant center，3D HISTECH)；掃描儀(V300，美國Epson公司)；勻漿儀(KZ-II，美國Servicebio公司)；電泳儀(DYCZ-24DN，DYCZ-40D，北京六一儀器廠)。

1.2方法

1.2.1建立動物模型

1.2.1.1建立急性哮喘(acute asthma，AA)組動物模型 參照文獻[4]建立AA動物模型。

1.2.1.2建立慢性哮喘(chronic asthma，CA)組動物模型 參照文獻[5]及本實驗組前期研究建立CA模型的方法，從實驗第21天起，采用1% OVA溶液進行霧化吸入激發，每天霧化30 min，持續霧化5 d，連續霧化9周。末次霧化24 h后脫頸處死小鼠，觀察到肺臟表面顏色蒼白，質硬，進一步行肺組織病理切片蘇木素-伊紅(H-E)染色，光學顯微鏡下可見支氣管皺襞明顯增多，上皮細胞明顯增生紊亂，管腔狹窄，氣道及血管平滑肌細胞增生等慢性哮喘氣道重塑病理變化，動物模型建立成功。

1.2.2分組 隨機均分為3組，即正常對照(normal control，NC)組、AA組和CA組。NC組不施加任何處理。

1.2.3肺組織病理切片H-E染色 觀察肺臟的大體病理變化，按照肺組織病理切片H-E染色標準步驟，經固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、染色、封片后，光學顯微鏡下觀察肺組織形態結構、炎癥細胞浸潤、氣道上皮損傷及氣道周圍病理改變。

1.2.4免疫組織化學法檢測Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達 按照免疫組織化學標準化步驟，將石蠟切片分別經脫蠟、抗原修復、血清封閉、加Smad蛋白一抗、加HRP標記山羊抗兔二抗、加SP、加顯色劑、復染、脫水、封片等處理。光學顯微鏡下觀察染色情況(深棕色為強陽性，棕黃色為中度陽性，淺黃色為弱陽性，藍色細胞核為陰性)，并使用Pannoramic組織切片掃描儀及Quant center軟件分析方法進行小鼠肺組織內Smad 1，3，4，5，7半定量的組織化學評分(histochemistry score，H-score)。

1.2.5Western-blot法檢測Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達 粉碎肺組織塊，按照Western-blot法規范化操作步驟，檢測Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達。

2 結 果

2.1肺臟大體情況觀察及肺組織病理形態學改變 NC組小鼠肺臟總體呈粉紅色，表面光滑、平整，無出血點及水腫，肺組織病理H-E染色后可見支氣管上皮細胞完整，黏膜無中斷，杯狀細胞低平，支氣管黏膜下及肺實質血管旁少許淋巴細胞浸潤(圖1A)。AA組小鼠肺臟總體呈暗紅色，表面充血水腫明顯，有較多出血點，顯微鏡下病理可見支氣管上皮細胞脫落，黏膜中斷，皺襞增加，杯狀細胞頂部空泡化明顯，肺泡間質水腫，支氣管黏膜下及肺實質血管旁可見以嗜酸性粒細胞為主的多種炎癥細胞浸潤(圖1B)。CA組小鼠肺臟顏色、質地不均一，紅白交雜，表面不平整，個別肺葉顏色蒼白、質硬；進一步行病理學檢測，顯微鏡下可見支氣管皺襞明顯增多，上皮細胞明顯增生紊亂，管腔狹窄，氣道及血管平滑肌細胞增生，肺泡破裂，黏膜下、毛細血管旁及肺泡內可見大量炎癥細胞浸潤(以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞及淋巴細胞為主)，且毛細血管旁淋巴細胞彌漫包圍(圖1C)。

2.2免疫組織化學法觀察小鼠肺內Smad 1，3，4，5，7的表達 各組小鼠肺組織內可見藍染的細胞核背景色，檢測NC組Smad 1，3，4，5指標，可見氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞細胞核不染色，呈陰性反應，細胞漿淡棕色，呈弱陽性反應(圖2A，D，G，J)，但Smad 7細胞質和細胞核均可見大面積深棕色顆粒，呈強陽性反應(圖2M)；AA組Smad 1，5氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞及氣道黏膜下、毛細血管旁及肺泡內浸潤的各類炎癥細胞，如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞等，細胞核、細胞漿均可見深棕色顆粒，呈強陽性反應(圖2B，K)，但CA組Smad 1，5陽性反應較AA組明顯減弱，呈中度陽性反應(圖2C，L)；AA及CA組的Smad 3，4氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞及浸潤的各類炎癥細胞細胞核、細胞漿均可見棕色顆粒，呈中度以上陽性反應(圖2E～F，H～I)。CA組與AA組比較，可見更大面積深棕色顆粒，呈強陽性反應(圖2F，I)。AA組肺組織內Smad 7較NC組陽性反應明顯減弱，呈弱陽性反應(圖2N)；但CA組與AA組比較，陽性反應增強，呈中度陽性反應(圖2O)。進一步行半定量的組織化學評分，AA組Smad 1，5表達較NC組增加明顯，差別有統計學意義(P<0.05)，但CA組較AA組減少明顯，差別有統計學意義(P<0.05)；AA組及CA組的Smad 3，4表達均較NC組升高(P<0.05);與AA組比較，CA組肺組織內Smad 3，4表達升高(P<0.05)；AA組肺內Smad 7表達較NC組降低(P<0.05)，但CA組較AA組表達升高(P<0.05)(表1)。

表1 免疫組織化學法檢測小鼠肺內Smad 1，3，4，5，7半定量的組織化學評分(H-sore)

Tab 1 Semi-quantitative histochemical scores of Smad 1, 3, 4, 5, 7 in the lungs of mice detected by immunohistochemisty (H-sore)

n=6. NC組：正常對照組；AA組：急性哮喘組；CA組：慢性哮喘組. 與NC組比較，△：P<0.05；與AA組比較，#：P<0.05.

2.3Western-blot法檢測Smad 1，3，4，5，7在肺組織表達 AA組小鼠肺組織內Smad 1，5蛋白的相對表達量均較NC組增加，差別有統計學意義(P<0.05)，但CA組較AA組明顯降低，且差別有統計學意義(P<0.05)；AA組及CA組的Smad 3，4的相對表達量均較NC組升高，差別有統計學意義(P<0.05)，且CA組比AA組表達量進一步升高(P<0.05)。AA組Smad 7的蛋白表達量較NC組降低明顯，差別有統計學意義(P<0.05)，但CA組比AA組表達量進一步升高，差別有統計學意義(P<0.05)(表2)。

3 討 論

哮喘是一種與變應源相關的、持續存在的慢性變應性氣道炎癥性疾病[6]，參與炎癥反應的各種生長因子如TGF-β，BMP等通過募集細胞內細胞信號傳遞分子Smads蛋白，進行核轉位，轉運入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞等炎癥細胞，導致哮喘變應性炎癥和氣道重塑[7]。Smad也被認為參與了CDKN2B基因編碼p15的表達控制，CDKN1A基因編碼p21，c-myc，ID1和ATF3的表達[8]。

表2 Western-blot法檢測Smad 1，3，4，5，7的相對表達量

n=6. NC組：正常對照組；AA組：急性哮喘組；CA組：慢性哮喘組. 與NC組比較，△:P<0.05；與AA組比較，#:P<0.05.

Smads蛋白成員主要包括Smad 1-8，可以分為3個亞家族：受體激活的Smad(Smad proteins regulated by the receptor, R-Smads)、協同作用的Smad(co-mediating Smad，Co-Smad)、起抑制作用的Smad(inhibitory Smad，I-Smad)[9]。R-Smads主要包括Smad 1，2，3，5，8，其負責將信號傳遞到細胞核，在結構上，均由僅連接結構不同的MH結構域(與果蠅蛋白Mad同源)組成，N-端區域(即MH1)結合DNA，C-端區域(即MH2)負責核轉錄啟動及調控。Co-Smad目前僅發現Smad 4蛋白，其可以與磷酸化R-SMAD蛋白形成R-SMAD-Co-SMAD復合物，進入細胞核，通過MH1結合TGF-β1、activins和BMP基因的CAGAC序列(SMAD-binding domain,SBD),對信號做出反應，以激活轉錄[10]。信號傳遞過程完成后，激活的R-Smad蛋白在特異磷酸酶作用下去磷酸化，同時，Smad 7誘導參與的已活化蛋白泛素化蛋白酶解和溶酶體降解。

目前，TGF-β1/Smads信號通路與支氣管哮喘、氣道重塑之間的關系逐漸得到大家的認識。TGF-β1可與細胞膜表面的TGF-β受體(TGF-β receptors，TGFR)結合，募集細胞質內的R-Smads即Smad 2，3，使其磷酸化而激活，進一步與Co-Smad協同作用進行核轉位，轉運入核激活靶向基因，激活、募集嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞等炎癥細胞，導致哮喘變應性炎癥[7]。本研究中，筆者觀察到AA組肺組織內Smad 3，4表達明顯升高，考慮TGF-β1/Smads信號通路在急性哮喘小鼠肺組織內活化激活。

同時，TGF-β1誘導成纖維細胞的趨化，刺激其增殖，增加成纖維細胞、纖連蛋白、蛋白聚糖、Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成以及抑制膠原酶和基質金屬蛋白酶的基因表達，導致氣道重塑[11]。另外，TGF-β1還可促進氣道平滑肌(airway smooth muscle，ASM)細胞增殖[12]。TGF-β1通過結合跨膜蛋白絲氨酸蘇氨酸激酶受體，磷酸化激活下游Smad 2，3信號蛋白，與Co-Smad協同作用進行核轉位進入細胞核發揮作用。Smad 2，3可以直接與DNA相結合而發揮作用，也可以同其他因子如P300/CBP、MSC1等協同激活DNA上其他因子轉錄，如激活MyoD、AR等的表達，而ski、HDACs等對Smad 2，3信號系統起負調節作用[8]。本研究中，筆者也觀察到CA組肺組織內Smad 3，4表達較AA組明顯升高，考慮慢性哮喘肺組織內TGF-β1/Smads信號通路極有可能在急性哮喘基礎上進一步活化。

BMPs在調控胚胎肺及支氣管發育過程中發揮重要作用，其可能在維持呼吸道穩態中發揮著重要作用[13]。Smad 1，5，8參與BMPs信號傳遞，可被ActR-I，BMPR-IA或BMPR-IB磷酸化而激活。Rosendahl等通過構建過敏性氣道炎癥實驗模型，研究了BMP蛋白水平的變化及Smad蛋白的激活[14]，發現與正常上皮細胞對比，炎癥化的支氣管上皮細胞和其他肺泡細胞表達磷酸化Smad 1(pSmad 1/5)，提示BMP/Smad信號通路的激活。在本研究中，筆者也觀察到AA組肺組織內Smad 1，5表達升高，考慮為急性哮喘時BMP/Smad信號通路被激活。但在慢性持續性過敏原刺激下的CA組卻觀察到Smad 1，5表達降低，其具體的機制及作用有待進一步研究。

Smad 7屬于I-Smad，結構與R-Smads完全不同，I-Smad只有C-端結構域，而沒有N-端結構域[9]。Smad 7可以抑制Smad 1，2，3，5，8信號通路，也可以通過誘導TGFR-Ⅱ受體降解，抑制R-Smad磷酸化，影響R-Smad-Co-Smad復合物的形成。I-Smad蛋白與R-Smad相互競爭，阻止其與受體或Smad 4結合，從而阻斷TGF-β1、BMP信號傳遞[15]。此外，Smad 7還參與SMURF2泛素連接酶向TGF-β1受體的募集，導致TGFR-I-TGFR-II復合物、Smad 7和Smad 2蛋白酶解和溶酶體降解[16]。本研究發現，AA組小鼠肺組織內Smad 7蛋白表達明顯降低，有助于TGF-β1信號通路的活化；而CA組肺組織內Smad 7蛋白高表達，是否與機體自身負反饋調節反應有關，有待進一步研究。