瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發性肝癌的機制研究

俞力 劉蘇

原發性肝癌是當前常見的人類惡性腫瘤之一[1]。肝癌的病情的發生、發展以及轉移等與多種基因突變、細胞信號傳導通路等分子水平機制密切關聯[2]。尋找一個有效的、敏感性及特異性較強的生物學靶點已成為臨床治療原發性晚期肝癌及阻止腫瘤轉移的研究的熱點。本研究探討瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發性肝癌的機制研究。

資料與方法

一、一般資料

本研究于2016年1月至2018年10月間收集于本院就診并接受治療的原發性晚期肝癌患者60例，全部經病理學確診；本研究中受試對象的平均發病年齡為 (53.61±9.59)歲。研究中的排除標準：研究排除近期(半年內)使用過VEGFR-TKI小分子藥物治療者；排除同時罹患高血壓、冠心病等疾病患者；排除吞咽困難、慢性腹瀉、消化潰瘍等腸道疾病者以及懷孕或哺乳期女性患者。本研究中患者使用的治療方案如下：口服瑞戈非尼(160 mg)，服藥時間和療程細則：d1～d21，28 d為一個療程。療效判斷依據RECIST完成評定，并計算總有效率。

二、免疫組織化學法檢測BRAF的蛋白表達水平

取原發性晚期肝癌患者癌組織石蠟切片標本，加入單克隆抗體BRAF和堿性磷酸酶二抗，進行4 ℃過夜孵育，次日加入SP和DAB進行顯色，封片并用顯微鏡進行觀察。計算癌組織中BRAF蛋白表達的平均光密度(mean density)。

三、細胞培養及細胞存活率

選取人肝癌SMMC-7721細胞株，使用胎牛血清作為RPMI培養液，濃度為10%，溫度控制在37 ℃，同時在5% CO2條件下進行復蘇培養。研究總共取對數生長期細胞用于后續分析，(細胞存活率實驗)，用瑞戈非尼(0.5 μmol/L，24 h)處理SMMC-7721細胞后更換培養基，再加入CCK8(10 μL)培養，培養條件：溫度仍然控制字37℃，同時在5% CO2條件下完成培養，培養時間為2 h，最后使用酶標儀測定OD值(450 nm波長處測定)，研究中通過比較分析細胞存活率和細胞凋亡率討論主題。

四、劃痕實驗

劃痕實驗中首先使用用瑞戈非尼0.5 μmol/L處理SMMC-7721細胞，24 h后將細胞接種于96孔板上，隨后使用劃痕儀對準96 孔板下端中央，輕推形成劃痕。漂洗(使用無血清培養基)3遍后加入低濃度血清培養24 h，最后對SMMC-7721細胞的遷移和侵襲能力進行評估。

五、Western Blot檢測蛋白含量表達

收取肝癌組織及SMMC-7721細胞株的蛋白并檢測蛋白濃度(總量調整為30 μg/μL)。將各組肝癌組織及SMMC-7721細胞株蛋白樣品進行電泳和轉膜，BSA封閉后加入BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表達一抗和堿性磷酸酶二抗。用顯色劑顯色并對條帶進行灰度掃描分析，計算肝癌組織及SMMC-7721細胞株BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2、NF-κB、BCL-2和Caspase 3蛋白的表達蛋白的表達量。

六、統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件處理數據，計數/等級資料采用例數和百分比描述，卡方檢驗進行差別的統計學檢驗；統計檢驗標準為：P<0.05(提示差異具有統計學意義)。

結 果

一、臨床療效觀察

瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發性肝癌總有效率為58.33%(35/60)。

二、免疫組化結果

原發性肝癌應用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內BRAF蛋白平均光密度含量明顯下降 (P<0.05)，見圖1。

圖1 BRAF免疫組化結果 (DAB顯色×400)

三、SMMC-7721細胞株細胞存活率、遷移和侵襲能力結果

研究中對肝癌SMMC-7721細胞株使用瑞戈非尼處理24 h后，可見細胞存活率顯著降低，同時凋亡率顯著增高，同時可見細胞遷移和侵襲能力明顯減弱(P<0.05)，見圖2。

圖2 肝癌SMMC-7721細胞株細胞存活率、遷移和侵襲能力結果

四、Western Blot檢測蛋白表達水平

原發性肝癌患者應用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量顯著降低，NF-κB和Caspase 3蛋白含量顯著升高(P<0.05)，見表1。本研究結果提示，SMMC-7721細胞株使用瑞戈非尼處理后，癌細胞內BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量均可見水平顯著降低，而NF-κB和Caspase 3蛋白含量則可見顯著升高(P<0.05)，見表2。

討 論

研究發現Raf基因家族成員中的癌基因BRAF與原發性肝癌等腫瘤的發生發展有關，該基因發揮調控作用的通路為絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen activated protein kinase，MAPK)信號轉導通路[3]，Ras/Raf/MEK/ERK 信號級聯通路是MAPK通路的下游信號系統，主要通過細胞外信號傳遞入細胞核內，進而調節細胞內特異蛋白表達水平[4]。細胞外信號分子一旦通過轉導或其他方式引發機體應激時，BRAF就會發揮MAPKKK的作用，并激活ERK影響細胞的增殖分化[5]。與此同時，NF-kB是磷脂酰肌醇-3-羥激酶PI3K/AKT和RAS/RAF/MEK/ERK下游的主要效應靶蛋白，其具有調控細胞凋亡基因轉錄等功能[6]，并且它可以抑制BCL-2表達，導致凋亡蛋白caspase 3活化以及凋亡的發生。

本研究結果表明，瑞戈非尼靶向作用BRAF基因治療原發性肝癌總有效率為58.33%，療效顯著。原發性肝癌應用瑞戈非尼靶向治療后，癌組織內BRAF蛋白平均光密度含量明顯下降，說明瑞戈非尼可有效抑制肝癌組織內BRAF表達、下調信號通路等方式影響腫瘤發生發展。當采用瑞戈非尼0.5 μmol/L處理肝癌SMMC-7721細胞株24h后，細胞存活率顯著降低，細胞遷移和侵襲能力明顯減弱，說明瑞戈非尼能持續抑制肝癌細胞的癌基因，肝癌SMMC-7721細胞株應用瑞戈非尼處理后，癌細胞內BRAF、RAF、p-MEK、p-ERK1/2和BCL-2蛋白含量顯著降低(P<0.05)，NF-κB和Caspase 3蛋白含量顯著升高(P<0.05)，瑞戈非尼能夠抑制肝癌細胞生長和增殖，調控BRAF-RAF-MEK-ERK信號通路促進肝癌SMMC-7721細胞株的細胞凋亡。

綜上所述，使用瑞戈非尼進行分子靶向治療，通過針對BRAF基因的干預完成對原發性肝癌的治療，主要機制為直接調控BRAF-RAF-MEK-ERK信號通路，通過促進肝癌細胞凋亡完成治療。希望基于本研究可以為瑞戈非尼的進一步臨床應用提供更多的理論依據。

表1 Western Blot檢測原發性肝癌患者癌組織內蛋白表達含量

注： 與治療前相比，*P<0.05

表2 Western Blot檢測肝癌SMMC-7721細胞株內蛋白表達含量

注： 與治療前相比，*P<0.05