靶向GPC3的人源化GPC3抗體的CAR-T細胞的構建

張皓然 門燕娟 徐鳳 陳全剛

摘?要：GC33是一種重組的全人源化單克隆抗體，可與磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）結合。為構建人源化GPC3抗體的CAR-T細胞，試驗選擇已有的GC33單鏈抗體序列成功構建了人源化GPC3-CAR分子，即GC33-CAR分子，并通過Western Blot對該CAR的表達進行驗證，通過免疫熒光檢查CAR的細胞定位。結果表明：GCC33-CAR分子能在T細胞中穩定表達且且該CAR表達后可被定位于細胞膜上。CAR-T細胞中CAR的人源化有望提升其治療效果，本研究為下一步的臨床研究提供了基礎。

關鍵詞：嵌合抗原受體細胞;肝細胞肝癌;人源化;磷脂同醇蛋白聚糖-3

引言

肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）目前是世界第5大腫瘤，也是癌癥致死的第3大因素。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）是一種硫酸乙酰肝素糖蛋白（heparin sulfate proteoglycans，HSPGs），在大多數的肝癌組織中呈特異性高表達，是一種較為理想的腫瘤治療靶點。以GPC3為靶點治療肝細胞癌的研究廣泛開展，目前利用GPC3-CAR-T細胞治療晚期肝細胞癌的Ⅰ期臨床試驗已正式啟動（受理號：CXSL 1700203）。相關研究表明，鼠源scFV序列的免疫原性會導致CAR-T細胞在體內無法活化及持續存在。在卵巢癌及腎細胞癌的治療過程中，針對鼠源scFV制備的CAR-T細胞的免疫應答導致了CAR-T細胞在輸入患者體內后很快耗竭，持久性差，影響了治療效果。GC33是一種重組的可與GPC3結合的全人源化單克隆抗體，一期臨床試驗結果顯示GC33在HCC中有良好的耐受性，且與靶向GPC3的抗體相比喪失了對人類的免疫原性，因此，本研究構建了GC33-CAR-T細胞并對其進行了初步驗證，為其后期應用于臨床治療奠定了基礎。

1 材料

293T細胞為本實驗室保存。RPM11640，DMEM，100x青霉素/鏈霉素，胎牛血清（GIBCO，美國），DNA聚合酶，DNA Maker，蛋白Maker，淋巴細胞分離液（GE，美國），抗人CD3抗體（eBio-science，美國），IL-2（PeproTech，美國），生物素標記的羊抗人IgG、HRP羊抗小鼠的二抗（Jackson，美國）。

2 方法

2.1 人源化GPC3抗體的構建

選擇已有的靶向GPC3的單鏈抗體序列GC33作為胞外區，CD8α作為鉸鏈區，CD28的跨膜結構域作為跨膜區，CD3ζ和共刺激分子CD28、CD137組成傳導信號的胞內信號區，通過基因合成上述序列，并插入至pRRL慢病毒載體，共同組成可以穩定表達于T細胞上的GC33-CAR分子。

2.2?攜帶人源化GPC3-CAR慢病毒的制備

使用分子克隆技術按上述設計將識別GPC3抗原的單鏈抗體GC33與共刺激分子CD28、CD137和CD3ζ鏈的胞內信號結構域進行基因重組，隨后通過人工合成和拼接技術，獲得靶向GPC3抗原的GC33-CAR基因片段。以XbaⅠ和BamHⅠ限制性酶切位點為克隆位點，利用亞克隆技術將GCC33-CAR基因片段插入慢病毒表達載體中，最終獲得攜帶GCC33-CAR基因片段的慢病毒表達載體pRRL-GC33-CAR。同時構建不含單鏈抗體區段的對照pRRL-control-CAR。293T細胞匯合度70%～80%時用更換含10%胎牛血清的DMEM新鮮培養基。將構建的慢病毒包裝質粒及輔助包裝質粒共轉染293T細胞，培養16 h后棄掉上清液并加入含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養。24 h后熒光顯微鏡觀察綠色熒光的發光情況，48 h后收取上清液，于4℃條件下12000×g離心20 min，0.45 μm濾器過濾后用1.5 mlEP管分裝后-80℃凍存備用。

2.3?人外周血單核細胞（PBMC）的制備及人源化GPC3-CAR慢病毒感染T細胞。

抽取健康志愿者外周血，經Ficoll-hypaque（葡聚糖-泛影葡胺）密度梯度離心法獲取單個核細胞（PBMC）后用培養基重懸。將細胞接種于6孔板中，加人IL-2和抗CD3抗體，置于37℃、5% CO2條件下培養過夜，觀察PBMC狀態，加入攜帶人源化GC33 CAR的重組慢病毒、對照病毒及聚凝胺。感染后的T細胞繼續培養后離心，吸棄1/2上清，再加入等量的新鮮培養基。繼續培養48 h后，熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，確定大部分PBMC被慢病毒感染，即為CAR-T細胞或對照T細胞。

2.4?Western blot檢測GPC3-CAR分子在T細胞內的表達

將上述收集的GC33-CAR-T細胞、未轉染的T細胞分別加入預冷的細胞裂解液，將提取的蛋白經10%的SDS-PAGE進行分離后，恒流轉印至PVDF膜上，并用5%的脫脂奶粉封閉，孵育Flag蛋白以及β-actin抗體4℃孵育過夜。用PBST洗滌3遍，每次5min，用HRP羊抗小鼠的二抗（1：2500）室溫孵育1 h。加人顯色劑化學發光后用印記顯影系統采集圖像。

3. 結果

3.1 高親和力人源化GPC3 scFv的構建。

將已有的靶向GPC3的單鏈抗體序列GC33，CD8α鉸鏈區，CD28，CD38鏈和共刺激分子CD28、CD137，通過連接鏈將這些結構串聯在一起，構建可以穩定表達于T細胞上的GC33-CAR分子（圖1）。

3.2 慢病毒包裝質粒轉染效率鑒定

將構建的的慢病毒包裝質粒轉染293T細胞，通過熒光顯微鏡觀察質粒轉染效率，從而確定病毒包裝情況。結果顯示，90%以上細胞呈現GFP陽性。

3.3?GC33-CAR分子在CAR-T細胞內表達。

包裝好的慢病毒分別侵染人T細胞，并添加IL-2促進T細胞增殖。72 h后通過Western Blot檢測各CAR的表達情況。結果顯示，在Control-CAR-T中可同時檢測到內源性CD3ζ和大小在40 KD左右的對照CAR條帶;而在GC33-CAR-T細胞中可見內源性CD3ζ和分子質量約55 kD的GC33 CAR的表達。提示構建的CAR可成功在T細胞中表達。

3.4?CAR的亞細胞定位鑒定

使用包裝好的Control-CAR及GC33-CAR慢病毒感染Hela細胞，通過使用myc抗體檢測CAR的亞細胞定位情況，結果顯示，Control-CAR及GC33-CAR均呈現明顯的細胞膜定位。

結論

本研究利用已知的GC33 scFv與其他序列連接構建出人源化CAR結構。經慢病毒包裝、感染，從而獲得了GC33-CAR-T細胞。并通過Western Blot證實了該CAR可成功在T細胞中表達，通過免疫熒光證實表達的CAR具有細胞膜定位的特性，進而成功構建了靶向GPC3的人源化CAR-T細胞的構建，為肝細胞癌的CAR-T治療提供了新的可行性手段。

參考文獻

[1]?謝春梅、徐偉文，GPC-3在肝癌診治中的價值及存在的問題，分子診斷與治療雜志2016.1第八卷第一期。

[2]?戴順志.人源化單抗在初期臨床試驗中能解決某些免疫原性問題[J].細胞與分子免疫學雜志，1992（01）：83-84.