我國人參產(chǎn)區(qū)灰霉病菌抗藥性研究初報(bào)

劉琨 李勇 王蓉

摘要 人參灰霉病給人參生產(chǎn)造成巨大損失。本研究選取人參生產(chǎn)上常用的4種殺菌劑，對(duì)東北人參產(chǎn)區(qū)分離的102株灰霉菌進(jìn)行抗性檢測(cè)。結(jié)果表明，灰霉菌對(duì)多菌靈carbendazim（C）、嘧霉胺pyrimethanil（P）、異菌脲iprodione（I）、咯菌腈fludioxonil（F）的抗性頻率分別為100%、86.27%、73.53%和30.39%，遼寧和吉林分離菌株對(duì)嘧霉胺、異菌脲的抗性高于3省平均水平。分離菌株對(duì)4種殺菌劑共有7種抗性類型，即CRPRIRFS、CRPRIRFR、CRPRISFS、CRPSISFS、CRPSIRFS、CRPRISFR和CRPSISFR，其所占比例分別為39.22%、26.47%、14.71%、7.84%、5.88%、4.90%和0.98%，未發(fā)現(xiàn)對(duì)4種殺菌劑均敏感的灰霉菌菌株。研究結(jié)果對(duì)于指導(dǎo)人參產(chǎn)區(qū)防治灰霉病殺菌劑的合理選用，有效降低人參農(nóng)藥殘留，延緩灰霉菌抗性產(chǎn)生具有重要意義。

關(guān)鍵詞 人參; 灰霉病; 抗藥性; 殺菌劑; 灰葡萄孢

中圖分類號(hào)： S 435.675 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019371

Abstract Gray mold causes great damage to ginseng production. In the present work， 102 strains of Botrytis cinerea were isolated from ginseng collected from 20 ginseng producing area， and their resistance to four types of fungicides was determined by minimal inhibitory concentration （MIC） method. Results indicated that the resistance ratio of B.cinerea against carbendazim （C）， pyrimethanil （P）， iprodione （I） and fludioxonil （F） were 100%， 86.27%， 73.53% and 30.39%， respectively. Resistance of B.cinerea isolates from Liaoning and Jilin provinces were higher than the mean. Furthermore， seven resistance types， CRPRIRFS， CRPRIRFR， CRPRISFS， CRPSISFS， CRPSIRFS， CRPRISFR and CRPSISFR， were detected， accounting for 39.22%， 26.47%， 14.71%， 7.84%， 5.88%， 4.90% and 0.98%， respectively. B.cinerea isolates susceptible to four fungicides have not been found. The results are important for guiding the reasonable selection of fungicides for ginseng grey mold control， effectively reducing ginseng pesticide residues and delaying the emergence of resistant isolates.

Key words ginseng; gray mold; resistance; fungicide; Botrytis cinerea

灰霉病是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要病害，化學(xué)防治是防治灰霉病最為經(jīng)濟(jì)、有效，且使用最為普遍的方法。自20世紀(jì)70年代，研究者相繼開發(fā)出苯并咪唑類、二甲酰亞胺類、N-苯基氨基甲酸酯類、苯基吡咯類、三唑類等灰霉病殺菌劑。灰霉菌繁殖快、遺傳變異大，極易產(chǎn)生抗藥性。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上灰霉病菌對(duì)嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺、腐霉利、異菌脲、乙霉威、嘧菌酯胺等常用殺菌劑均已產(chǎn)生抗性，由于殺菌劑的不合理使用，田間已經(jīng)出現(xiàn)“雙抗”甚至“多抗”灰霉菌株系[1]。

人參Panax ginseng C. A.Mey.為五加科植物，別名棒槌、地精、神草等，是我國馳名中外的名貴藥材，被譽(yù)為“百草之王”[2]。近年來人參灰霉病發(fā)生日趨嚴(yán)重，已成為人參生產(chǎn)上的重要病害之一。據(jù)初步調(diào)查，長白山區(qū)人參灰霉病病田率已達(dá)75%，病株率達(dá)到5%～60%，人參灰霉病防治過程中殺菌劑使用不規(guī)范不僅造成人參農(nóng)藥殘留超標(biāo)，同時(shí)也嚴(yán)重影響了人參品質(zhì)，給人參生產(chǎn)造成了巨大損失[3]。

目前，已有的報(bào)道主要集中在人參灰霉病殺菌劑篩選[3-4]、復(fù)配[5-6]、研發(fā)[7]等領(lǐng)域，人參灰霉菌抗藥性報(bào)道相對(duì)較少。僅見Lu等[8]對(duì)吉林省長白縣76株人參灰霉菌對(duì)多菌靈、異菌脲、嘧霉胺、嘧菌酯的抗藥性研究。鑒于人參灰霉病在整個(gè)人參產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的嚴(yán)峻形勢(shì)，本研究在對(duì)黑龍江、吉林、遼寧人參產(chǎn)區(qū)灰霉菌株分離鑒定的基礎(chǔ)上，進(jìn)行室內(nèi)抗藥性檢測(cè)，以期明晰我國人參產(chǎn)區(qū)灰霉病菌抗藥性現(xiàn)狀，為人參灰霉病防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 人參灰霉菌菌株

2018年6月-8月分別從黑龍江、吉林、遼寧人參產(chǎn)區(qū)采集灰霉病樣，共計(jì)分離、純化獲得102株灰霉病菌。不同產(chǎn)區(qū)分離獲得的菌株信息詳見表1。全部菌株經(jīng)顯微形態(tài)學(xué)及分子鑒定，確認(rèn)為灰葡萄孢Botrytis cinerea。

1.2 供試殺菌劑

50%多菌靈可濕性粉劑，江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司;500 g/L異菌脲懸浮劑，蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司;400 g/L嘧霉胺懸浮劑，拜耳股份公司;25 g/L咯菌腈懸浮劑，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。

1.3 菌株活化與菌餅制備

取4℃保存的純化菌株，20℃活化培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，備用。

1.4 人參灰霉菌抗藥性測(cè)定

采用最小抑制濃度法檢測(cè)人參灰霉菌抗藥性[9]。多菌靈和異菌脲工作濃度為10 μg/mL，嘧霉胺工作濃度為1 μg/mL，咯菌腈工作濃度為0.1 μg/mL[10-13]。嘧霉胺使用ASP培養(yǎng)基，避免培養(yǎng)時(shí)間影響灰霉菌對(duì)供試殺菌劑的敏感性[11]。其余3種殺菌劑使用PDA培養(yǎng)基。除多菌靈用二甲基亞砜溶解外，其余殺菌劑均使用無菌水溶解制成母液。將培養(yǎng)基冷卻到50℃左右時(shí)，加入藥劑母液后充分混勻，倒入直徑6 cm培養(yǎng)皿內(nèi)。將事先活化的灰霉菌餅接入含藥平板中心。每菌株3次重復(fù)，以溶劑和等量無菌水作為空白對(duì)照。20℃黑暗培養(yǎng)72 h后統(tǒng)計(jì)殺菌劑的抗藥性頻率。完全不生長的為敏感菌株;反之，則為抗性菌株。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2017對(duì)人參灰霉菌抗性頻率、抗性類型相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參灰霉病菌抗性頻率

抗性檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示，東北3省人參產(chǎn)區(qū)的灰霉菌對(duì)多菌靈、嘧霉胺、異菌脲、咯菌腈的抗性頻率分別為100%、86.27%、73.53%和30.39%。不同省份分離的菌株對(duì)嘧霉胺和異菌脲的抗性頻率存在較大差異，對(duì)咯菌腈的抗性頻率表現(xiàn)為略有差異。遼寧和吉林分離菌株對(duì)嘧霉胺、異菌脲的抗性高于3省平均水平，而黑龍江分離菌株低于平均水平。

2.2 人參灰霉病菌抗性類型

抗藥性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，供試人參灰霉病菌共7種抗性類型，即CRPRIRFS、CRPRIRFR、CRPRISFS、CRPSISFS、CRPSIRFS、CRPRISFR和CRPSISFR，其所占比例分別為39.22%、26.47%、14.71%、7.84%、5.88%、4.90%和0.98%（表3）。黑龍江7種抗性類型均有分布，其余兩省分布有除CRPSISFR外的其余6種抗性類型。對(duì)4種殺菌劑均有抗藥性的灰霉菌株（CRPRIRFR）占26.47%，三抗菌株（CRPRISFR和CRPRIRFS）占44.12%，雙抗菌株（CRPRISFS、CRPSIRFS和CRPSISFR）占21.57%，單抗菌株（CRPSISFS）占7.84%，不存在對(duì)4種殺菌劑均敏感的灰霉菌株。其中，對(duì)多菌靈、嘧霉胺、異菌脲均具有抗性的灰霉菌株CRPRIRFS類型占比最大（39.22%）。

3 討論

本研究對(duì)供試的4種殺菌劑檢測(cè)結(jié)果顯示，部分灰霉菌菌株已對(duì)4種殺菌劑產(chǎn)生了抗性，且表現(xiàn)“全抗”的菌株在灰霉菌群體中所占比例較高，存在病害大流行風(fēng)險(xiǎn)。4種殺菌劑中多菌靈已完全失去效果，在人參生產(chǎn)過程中建議停止使用。腐霉利和異菌脲均屬于二甲酰亞胺類藥劑，該類藥劑是甘油三酯合成抑制劑，能夠抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)，因多年使用已導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗性，防治效果顯著降低[14]。嘧霉胺屬于苯并咪唑類殺菌劑，其作用靶點(diǎn)單一，易使病菌產(chǎn)生抗性，屬于高抗性風(fēng)險(xiǎn)殺菌劑[15]。目前，東北人參產(chǎn)區(qū)灰霉菌對(duì)嘧霉胺和異菌脲的抗性很普遍[16]。苯吡咯類殺菌劑是一類新型、廣譜、高效的內(nèi)吸性殺菌劑，可抑制菌絲體生長、孢子萌發(fā)和芽管伸長[17]。東北地區(qū)人參灰霉病菌對(duì)咯菌腈的抗性頻率較低。

在我國，多菌靈（苯并咪唑類）、腐霉利（二甲酰亞胺類）、異菌脲（二甲酰亞胺類）、咯菌腈（苯吡咯類）、嘧霉胺（苯胺基嘧啶類）、啶酰菌胺（煙酰胺類）、抑霉唑（咪唑類）及福美雙（有機(jī)硫類）是防治人參灰霉病的常用殺菌劑。啶酰菌胺是新型煙酰胺類殺菌劑，藥劑通過植物葉面滲透到植物體中并可在植物體中傳導(dǎo)，其持效期長，被廣泛應(yīng)用于灰霉病的防治[18]。灰霉菌對(duì)啶酰菌胺敏感，在生產(chǎn)中可將啶酰菌胺與腐霉利、咯菌腈交替使用來延緩和治理抗性[19]。咪唑類殺菌劑又稱為DMIs殺菌劑，其通過抑制14-α-脫甲基酶使真菌體內(nèi)的麥角甾醇生物合成受阻而起到抑菌作用。抑霉唑是DMIs殺菌劑中的一種，其與腐霉利、異菌脲、咯菌腈、嘧霉胺、啶酰菌胺及福美雙不存在交互抗性，被廣泛用于防治植物真菌病害[20]。福美雙屬于有機(jī)硫類殺菌劑，因存在殺菌能力弱、水溶性低、復(fù)配能力差等缺點(diǎn)，目前研究較少[21]。

綜上，在人參生產(chǎn)上應(yīng)盡快尋找新型可替代殺菌劑以防止灰霉病流行造成重大經(jīng)濟(jì)損失。另外，要盡快建立早期預(yù)警機(jī)制，在病害發(fā)生和流行初期用藥，減少用藥次數(shù)，防止抗性發(fā)生或延緩抗性群體的形成;還要根據(jù)抗性菌株的區(qū)域分布、抗性頻率和水平制定科學(xué)合理的用藥措施。

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（責(zé)任編輯： 楊明麗）