加強果樹規范化采樣和病毒檢測 降低潛隱和危險性病毒對我國蘋果產業的危害風險

董云浩 謝吉鵬 李夢菲

摘要 蘋果病毒病在世界各蘋果產區廣泛發生，危害嚴重，目前沒有有效的防治藥劑。蘋果病毒具有潛隱危害、主要以嫁接方式傳播的特點。危險性高的類病毒侵染導致蘋果果實幾乎失去經濟價值。蘋果病毒的檢測是防止其傳播和危害，繁育無病毒苗木和蘋果樹無毒化管理的一項關鍵技術。由于對病毒在蘋果樹體中的組織分布和濃度認知不到位，蘋果病毒檢測中存在樣品采集和檢測方法的誤區。本文根據課題組十年來開展蘋果病毒檢測和研究工作的數據，簡要概述了我國蘋果病毒的發生危害特點，蘋果病毒檢測方法，詳細給出了規范的樣品采集、處理、總RNA提取、RT-PCR參數、檢測引物、對照設置及檢測結果判別的技術方法。

關鍵詞 蘋果病毒; 潛隱病毒; 暴發風險; RT-PCR; 檢測

中圖分類號： S 432.1 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019011

Abstract Virus diseases on apple trees occur worldwide and induce severe losses. To date， no pesticides are effective for virus diseases. Apple viruses cause latent infection and mainly transmit by grafting. Dangerous viroids infection may result in complete loss of economic value of apple fruit. Detection of apple viruses is effective to control their transmission and acts one of key measures for both virus-free seedling propagation and apple tree management. As there is a gap to know the tissue distribution and titer of viruses in apple trees， there are some misunderstandings for sample collection and detection methods. Here， based on our research and detection work on apple viruses for ten years， we briefly introduced the occurrence characteristics of apple viruses in China， detection methods， and the standard technical methods in detail that cover sample collection， processing， total RNA isolation， RT-PCR parameters， controls and results analysis. The detection primers were fully listed.

Key words apple virus; latent viruses; risk of outbreak; RT-PCR; detection

蘋果病毒病在世界各蘋果產區廣泛發生，具有危害性強、傳播擴散快的特點。病毒破壞和干擾果樹正常生理功能，導致樹勢減弱，產量降低，果實畸形、著色不勻、品質下降，造成嚴重經濟損失[1-3]。國外自20世紀40年代已開始了對蘋果病毒病的調查研究，目前多數蘋果主要生產國基本上實現了蘋果的無毒化栽培[4]。我國對蘋果病毒病的研究起步較晚，雖然目前基本明確了我國蘋果主產區病毒病的種類、分布，建立了病毒檢測方法，但由于蘋果病毒在樹體中的含量低，分布和濃度因季節和組織而異，同時蘋果病毒序列變異大，此外，檢測中通常未設內參基因做對照，導致檢測假性率高，數據不一致，制約了我國蘋果病毒病可持續控制。

當前正值我國大面積推廣矮砧密植蘋果栽培方式，其育苗過程中要通過兩次嫁接來實現早結果和早豐產。這種通過兩次嫁接培育蘋果苗的方法大大增加了病毒傳播和復合侵染的幾率。同時由于新建果園和需更新的果園面積大，苗木需求量巨大，市場基本無秩序和無監管，使得矮砧苗病毒病問題愈發嚴重，已危及我國蘋果苗木的健康繁育，給我國蘋果安全生產帶來了極大的風險。利用無病毒苗木和加強病毒檢測是目前控制蘋果病毒病和防止其傳播擴散的有效途徑，特別是對采穗母本樹實施病毒檢測，是確保蘋果苗木低毒化、無毒化和提升果品質量的關鍵。

本文根據課題組十年來開展蘋果病毒檢測和研究工作中取得的數據及發表的文章，首先概述了我國蘋果病毒的發生危害特點，列舉了檢測方法，然后在整理、綜合國內外研究建立的反轉錄（RT）-PCR檢測蘋果病毒技術的基礎上，給出規范的從樣品采集、處理、總RNA提取、RT-PCR參數、檢測引物、對照設置到檢測結果判別的技術方法，供蘋果病毒相關研究和育苗栽培生產中參考使用。

1 我國蘋果病毒的種類及發生特點

根據對我國蘋果主要產區（環渤海灣產區、黃土高原產區、黃河故道產區和西南高地產區）病毒病多年來的調查結果和病原檢測結果進行分析，明確了我國蘋果上發生的病毒種類和特點。一是病毒種類多。已明確的我國蘋果上發生的主要病毒有6種，分別是蘋果褪綠葉斑病毒Apple chlorotic leaf spot virus（ACLSV）、蘋果莖溝病毒Apple stem grooving virus（ASGV）、蘋果莖痘病毒Apple stem pitting virus（ASPV）、蘋果壞死花葉病毒Apple necrosis mosaic virus（ApNMV）、蘋果銹果類病毒Apple scar skin viroid（ASSVd）和蘋果凹果類病毒Apple dimple fruit viroid（ADFVd）[3，5-7]。其中，前三種（ACLSV、ASGV和ASPV）侵染蘋果通常不引起明顯的癥狀，因此也稱為潛隱病毒。ApNMV是最近鑒定的引起我國蘋果花葉病的主要病毒[7];ASSVd和ADFVd屬于類病毒，雖然在蘋果枝干和葉片上不引起癥狀，但對蘋果果實危害最大，ASSVd引起蘋果銹果病和花臉病，ADFVd引起蘋果凹果病，受危害的果實幾乎喪失經濟價值[5]。二是發生率高。ACLSV和ASGV的發生率均高于60%，一些果園達100%，ASPV發生率一般在20%以上，相對較低;蘋果花葉病發生率近年來明顯增加，特別是一些新發展的蘋果生產區，發生率高于30%[5]。三是復合侵染普遍。經檢測，兩種及更多種病毒復合侵染的發生率為60%～100%，病毒復合侵染通常產生協生作用，其危害比一種病毒單獨侵染更加嚴重，顯著降低樹勢和縮短盛果期[5]。四是蘋果花臉病、銹果病對我國蘋果產業造成重大危險。近年來富士蘋果上發生的花臉病呈暴發趨勢，特別是山東和黃土高原產區，新樹結果后即表現果實花臉癥狀，調查發現發生率為8%～100%，對我國蘋果產業危害和風險最大;雖然蘋果凹果病目前僅在山東和新疆發現，但潛在危害不容忽視[5]。

2 蘋果病毒主要檢測方法

蘋果病毒檢測有多種方法，如指示植物法，電子顯微鏡技術，酶聯免疫技術，分子生物學技術，以及近年來用于病毒鑒定的深度測序技術[9-11]。分子生物學技術通過檢測病毒核酸來證實病毒的存在，其靈敏度高，特異性強，檢測快速，并可用于大量樣品的檢測，適用范圍廣。目前，常用的分子生物學技術包括核酸分子雜交技術、雙鏈RNA 電泳技術、RT-PCR技術等，其中RT-PCR 技術由于其準確度高、操作性和實用性強，是目前適宜推廣的蘋果病毒檢測方法。

3 規范化的蘋果樣品采集和保存方法

不同生長期、不同組織中蘋果病毒的含量差別大，無論使用哪種檢測方法，都應在適宜時間采集病毒含量相對高的樣品，并對樣品進行恰當保存和運輸，以提高蘋果病毒檢測準確度和檢測效率。

采樣時期：春季4、5月份，蘋果萌芽和新梢生長期是各種病毒從根部移動到枝條并快速增殖的時期，此時樹體內病毒含量高，是采集蘋果病毒檢測樣品的最佳時期。

組織類型和取樣方法：蘋果樹不同組織內病毒含量不同，為提高檢測準確度，應選取病毒含量高的組織進行取樣。依據我們對多地多年蘋果樣品的選取和檢測，建議優先選取的蘋果樣品為嫩芽、花、韌皮部組織和嫩葉。春季剪取生長旺盛的新梢或帶花的枝條，其他季節剪取兩年生15～20 cm長的枝條或帶有嫩葉的枝條用于剝取韌皮部組織。每株樣品標記序號、品種、地點、采集人、采集時間等信息，裝入塑料袋密封。蘋果果皮中病毒含量高，也是一種常選擇的取樣組織。發育成熟的葉片及老熟葉片中病毒含量低，不建議采集。

取樣數量：取樣數量以檢測目的而定，用于育苗的采穗母本樹，應逐一進行單株取樣和檢測;苗圃中的幼苗或幼樹建議按不小于1%或至少3株隨機取樣，并標記取樣株。

樣品保存與運輸：因離體組織中的核酸極易降解，應盡快對樣品進行檢測。樣品可在4～10℃下保存5～7 d。需長期保存時，將嫩芽、花、嫩葉、刮取的韌皮部組織直接用液氮速凍后置于-20℃冰箱保存1個月或置于-80℃冰箱保存半年。若需郵寄或長途運輸時，嫩梢和枝條用濕潤的報紙或吸水紙包住，或者用保鮮膜完全裹住，放在塑料袋中密封保濕運輸。收到樣品后應立即開展檢測或進行保存。

4 蘋果病毒的RT-PCR檢測技術

該技術包括蘋果樣品總RNA的提取和質量檢測、反轉錄、PCR和結果判別4個步驟。

4.1 蘋果病毒RT-PCR檢測方法使用的試劑與設備 ?試劑：dNTPs、Taq DNA、M-MLV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、瓊脂糖、10×Loading Buffer、DNA Marker。

設備：水浴鍋、PCR儀、電泳儀及電泳槽、JY04S-3C型紫外凝膠成像儀。

4.2 蘋果樣品總RNA提取和質量檢測

因蘋果組織中多酚、多糖含量高，常規TRIzol提取法不適用，推薦使用二氧化硅吸附法提取總RNA，具體方法見備注2。也可以使用常規的CTAB提取法，這里不做詳細介紹。

為保證檢測準確度，應對總RNA的質量進行檢測：利用紫外分光光度計檢測提取的總RNA純度和濃度。OD260/OD280在1.8～2.2時，總RNA純度符合要求。濃度計算公式為 RNA（μg/mL）=OD260值×40。

4.3 反轉錄

通常采用隨機六聚體引物進行反轉錄，以便用于檢測多種主要蘋果病毒。僅需檢測一種病毒時，可以使用特異性反向引物（表1）進行反轉錄。具體為：

在1.5 mL離心管中加入蘋果樣品總RNA 3.5 μL、隨機引物（10 μmol/L）0.5 μL、Oligo dT（10 μmol/L）0.5 μL、5×M-MLV Buffer 4.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL、RNA酶抑制劑0.5 μL、M-MLV反轉錄酶（200 U/μL）0.5 μL，加DEPC ddH2O 至20 μL，42℃反應1 h，cDNA用于PCR或保存于-20℃備用。

4.4 PCR

鑒于蘋果病毒的復合侵染普遍，這里給出了常規PCR和多重PCR兩種方法。常規PCR適用于單獨對每種蘋果病毒進行檢測，多重PCR檢測方法適用于同時檢測多種蘋果病毒。檢測引物見表1。鑒于ASSVd和ADFVd同屬于蘋果銹果類病毒屬Apscarviroid，可使用該屬的通用引物對apscarviroids-F和apscarviroids-R進行檢測。PCR體系應設置空白對照（超純水）、陰性對照（健康或不帶病毒樣品）、陽性對照（帶有病毒的蘋果組織材料）和內參對照。推薦使用蘋果EF-1α基因作為內參（引物對EF-1α-F和EF-1α-R，詳見表1）。

常規PCR：選用表1中所列每種病毒的特異引物分別進行常規PCR。反應體系包括反轉錄產物cDNA 2.0 μL、10×PCR Buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、正向引物（20 μmol/L）0.5 μL、反向引物（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為94℃預變性3 min;94℃變性30 s，對應引物適宜退火溫度（表1）復性45 s，72℃對應延伸1 min，反應35個循環;最后72℃延伸10 min。

多重PCR：反應體系為反轉錄產物cDNA 2.0 μL、10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.5 μL、ACLSV-F（20 μmol/L）1.0 μL、ACLSV-R（20 μmol/L）1.0 μL、ASGV-F1（20 μmol/L）1.0 μL、ASGV-R1（20 μmol/L）1.0 μL、ASPV-F1（20 μmol/L）0.4 μL、ASPV-R1（20 μmol/L）0.4 μL、apscarviroids-F（20 μmol/L）0.5 μL、apscarviroids-R（20 μmol/L）0.5 μL、EF-1α-F（20 μmol/L）0.5 μL、EF-1α-R（20 μmol/L）0.5 μL、Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0. 5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件為94℃預變性3 min;94℃變性30 s，53℃復性45 s，68℃延伸2 min，35個循環;最后72℃延伸10 min。

4.5 檢測結果判別

PCR反應結束后，取5～10 μL產物加入DNA上樣緩沖液，使用預先做好的1%～1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，120～150 V電壓電泳約30 min，用0.5 μg/mL溴化乙錠或其他DNA染料染色10 min。在凝膠成像儀中利用紫外光觀察條帶位置，如果出現與陽性對照樣品擴增的條帶位置相同的預期特異性條帶（片段大小參考表1），初步判斷為陽性樣品。如果需要進一步確認，則將PCR產物直接進行測序或將目標條帶切膠純化后測序。將測序獲得的序列在GenBank網站（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進行BLASTn比對，根據比對獲得的序列相似度最高的病毒確定是否為目標病毒。如果未觀察到目標條帶，與陰性對照樣品一樣，則說明樣品中不含有待檢病毒。

附錄

1.蘋果組織總RNA的二氧化硅吸附提取法[19]

操作步驟：

1） 用液氮預冷研缽，取約0.1 g植物組織（葉片、韌皮部或果皮）放于研缽中研磨，將研磨后的粉末轉入1.5 mL離心管中。

2） 向離心管中加入1 mL研磨緩沖液和100 μL 2%偏重亞硫酸鈉，振蕩混勻。

3） 短暫離心，取800 μL勻漿轉入事先加入150 μL 10%十二烷基肌氨酸鈉的離心管中，70℃保溫10 min（中間顛倒混勻3～4次），冰上放置5 min，12 000 g離心10 min。

4） 取上清轉入含有150 μL無水乙醇、300 μL 6 mol/L碘化鈉、30 μL 10%二氧化硅懸浮液（pH 2.0）的離心管中，室溫振蕩20 min。

5） 6 000 r/min離心1 min，棄去上清，加入500 μL清洗緩沖液振蕩懸浮沉淀，6 000 r/min離心1 min。

6） 重復步驟（5）1至2次。

7） 將離心管反扣在紙巾上，用槍頭吸掉管中殘余的上清，室溫下自然干燥3～5 min，加入80 μL 無核酶的純水，振蕩懸浮，70℃保溫4 min。

8） 13 000 r/min 離心3 min，吸取上清60 μL，用于合成cDNA或保存-80℃。

試劑配制：

以下試劑均用無核酶的純水或焦磷酸二乙酯（DEPC）處理的ddH2O水進行配制。

10%二氧化硅懸浮液：稱取SiO2微粒20 g于200 mL 無核酶的純水中，搖勻，沉淀一晝夜;倒掉上清，加水至200 mL，搖勻，沉淀5 h;倒掉176 mL上清，留下24 mL粉漿用鹽酸調節pH=2.0;高溫高壓滅菌后分裝于1.5 mL離心管，4℃保存。

2%偏重亞硫酸鈉：稱取偏重亞硫酸鈉1 g溶于50 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

10%十二烷基肌氨酸鈉：稱取十二烷基肌氨酸鈉5 g溶于50 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

6 mol/L碘化鈉：稱取90 g碘化鈉溶于100 mL水中，攪拌均勻，高溫高壓滅菌，4℃保存。

研磨緩沖液：稱取（異）硫氰酸胍23.6 g，醋酸鈉（NaAC）0.82 g，EDTA 0.37 g，醋酸鉀（KAC）4.9 g，PVP-K30 1.25 g溶于50 mL水中，攪拌混勻，高溫高壓滅菌，冷卻后4℃保存，使用前加入適量2%偏重亞硫酸鈉。

清洗緩沖液：取Tris堿0.30 g溶于125 mL水，鹽酸調節pH=7.5，稱取0.04 g EDTA，0.73 g NaCl加入以上Tris-HCl中，加入無水乙醇125 mL，定容至250 mL，4℃保存。

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（責任編輯： 楊明麗）