利用凝膠擴(kuò)散法測(cè)定刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性

趙丹丹 楊龍 黃兆峰

摘要 β-甘露聚糖酶是種子萌發(fā)過(guò)程中降解胚乳細(xì)胞壁的關(guān)鍵酶，明確其活性的動(dòng)態(tài)變化可為揭示雜草種子的休眠萌發(fā)機(jī)制提供重要依據(jù)。以外來(lái)雜草刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal種子為材料，建立了種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測(cè)方法—凝膠擴(kuò)散法。利用凝膠擴(kuò)散法對(duì)不同貯存時(shí)間及貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)貯存3年以上的種子中該酶的活性為0.03 nmol/（min·mg），顯著低于貯存3年以下的種子中的酶活性0.15 nmol/（min·mg），而濕潤(rùn)冷藏的種子中β-甘露聚糖酶的活性為0.12 nmol/（min·mg），顯著高于干燥冷藏的種子的酶活性0.02 nmol/（min·mg）。實(shí)際應(yīng)用結(jié)果表明，凝膠擴(kuò)散法綜合了傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可同時(shí)檢測(cè)大量種子樣品，具有良好的實(shí)用性。

關(guān)鍵詞 刺萼龍葵; β-甘露聚糖酶; 種子; 凝膠擴(kuò)散法

中圖分類(lèi)號(hào)： S 451.0 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019027

Abstract Endo-β-mannanase （EBM） is a key enzyme in degradation of endosperm cell walls during seed germination process. Understanding the dynamics of EBM activities will provide important guidance for elucidating the mechanisms of weed seed dormancy and germination. For determination of EBM activity in seeds of an invasive plant， Solanum rostratum Dunal （buffalobur）， a gel diffusion assay was established. The EBM activities in buffalobur seeds with different storage time and under different storage conditions were detected by this method. The results showed that the EBM activity in seeds stored longer than 3 years [0.03 nmol/（min·mg）] was significantly lower than that of seeds stored less than 3 years [0.15 nmol/（min·mg）]. Whereas for seeds stored wet in the refrigerator [0.12 nmol/（min·mg）]， the EBM activity was significantly higher than that of seeds stored dry in the refrigerator [0.02 nmol/（min·mg）]. The practical application verified that the gel diffusion assay， which took advantages of traditional methods， was a specific， highly sensitive and reproducible method， and could analyze a large number of seed samples simultaneously.

Key words Solanum rostratum; endo-β-mannanase; seed; gel diffusion assay

種子是雜草發(fā)生危害的根源和傳播擴(kuò)散的重要載體，關(guān)系到種群的生存和發(fā)展[1-2]。種子內(nèi)通常存在細(xì)胞壁加厚的胚乳細(xì)胞，可以阻礙胚根突破種皮，其細(xì)胞壁的降解是種子萌發(fā)的前提。β-甘露聚糖酶是降解胚乳細(xì)胞壁主要成分半乳甘露聚糖的關(guān)鍵酶，明確其活性的動(dòng)態(tài)變化對(duì)揭示雜草種子的萌發(fā)調(diào)控機(jī)理，進(jìn)而制定有針對(duì)性的雜草綜合防控措施具有重要意義。半乳甘露聚糖是大多數(shù)種子胚乳細(xì)胞壁的主要成分，在茄科植物種子中可達(dá)60%[3-4]。研究表明，β-甘露聚糖酶在番茄、萵苣、曼陀羅[5-7]等植物的種子萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，主要水解甘露聚糖主鏈之間的β-1，4共價(jià)鍵，側(cè)鏈及水解產(chǎn)物可由同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶協(xié)同降解[3，8]。由于β-甘露聚糖酶與種子的休眠萌發(fā)密切相關(guān)，其在20世紀(jì)70年代已引起國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注，我國(guó)對(duì)該酶的研究主要集中在微生物發(fā)酵和飼料添加劑方面，在植物種子中的相關(guān)研究則較少[9-11]。

種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測(cè)是研究甘露聚糖酶的關(guān)鍵，其活性受內(nèi)外因素影響較大，檢測(cè)結(jié)果也易受β-甘露聚糖酶同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶的影響。傳統(tǒng)β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定主要有黏度測(cè)定法和分光光度法，前者準(zhǔn)確度較高，但操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng);后者對(duì)部分種子測(cè)定效果好，但通用性差、準(zhǔn)確度低[12]。β-甘露聚糖酶對(duì)調(diào)控種子的萌發(fā)具有重要作用，明確種子萌發(fā)過(guò)程中β-甘露聚糖酶活性的動(dòng)態(tài)變化，可為揭示外來(lái)雜草刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal種子的休眠萌發(fā)機(jī)制提供依據(jù)。采用傳統(tǒng)方法測(cè)定β-甘露聚糖酶活性時(shí)適用性和效率不高，因此有必要建立一種可靠、有效的檢測(cè)方法。本研究以刺萼龍葵種子為研究對(duì)象，基于Downie等[13]和Still等[14]的凝膠擴(kuò)散法，擬優(yōu)化建立一種靈敏度高、操作簡(jiǎn)便的測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)種子中β-甘露聚糖酶活性的準(zhǔn)確和高效檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 種子來(lái)源與處理

2007年-2011年連續(xù)5年在北京采集成熟刺萼龍葵種子，并對(duì)2007年種子分別采用濕潤(rùn)冷藏（4℃）、干燥冷藏（4℃）和室溫干燥（25℃）3種貯存方式備用。待測(cè)種子處理時(shí)2007年-2011年貯存的種子相應(yīng)的貯存年限為5年～1年。剔除有機(jī)械損傷的種子和雜物，每處理選取30粒種子用蒸餾水反復(fù)沖洗3次、1%次氯酸鈉浸泡10 min，再將種子轉(zhuǎn)移至墊有兩層濾紙、含5 mL蒸餾水的直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)30℃、黑暗條件下培養(yǎng)。分別選取相同培養(yǎng)時(shí)間的種子進(jìn)行β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定。

1.2 凝膠擴(kuò)散法基本方法與原理

將含有β-甘露聚糖酶的種子粗酶提取液置于含有該酶專(zhuān)一性底物-甘露聚糖的瓊脂糖培養(yǎng)基中，通過(guò)粗酶提取液中的β-甘露聚糖酶與底物接觸，培養(yǎng)催化種子粗酶液水解底物。由于β-甘露聚糖酶的水解作用可使水解后的底物與染色劑剛果紅的結(jié)合能力喪失，利用底物與剛果紅結(jié)合能力的差異進(jìn)行染色，可在凝膠上形成明顯的透明消化圈。根據(jù)透明消化圈直徑大小與β-甘露聚糖酶活性的線性關(guān)系，可以確定待測(cè)種子中酶活性的強(qiáng)弱[13，15]。

1.3 刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的測(cè)定

參照Downie等[13]和Still等[14]的凝膠擴(kuò)散法，按照以下試驗(yàn)步驟進(jìn)行刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活力的測(cè)定。

1.3.1 凝膠制作

用0.2 mol/L磷酸氫二鈉-0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH=5）配制濃度為0.05%（m/V） LBG（Locust bean gum）溶液，置于95℃的水浴鍋中保溫并攪拌30 min，隨后停止加熱，冷卻并將懸浮液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，于4℃、11 000 g離心15 min。取離心后上清液配制0.8%（m/V）的瓊脂糖溶液，微波加熱溶解，冷卻至65℃左右，取27 mL上述溶液倒入水平放置的規(guī)格為100 mm×100 mm×15 mm的一次性方形培養(yǎng)皿中，凝膠厚度為5 mm。室溫下聚合1 h后，用直徑為2 mm的凝膠打孔器在培養(yǎng)皿內(nèi)的凝膠上均勻打36孔，移除孔中殘留的凝膠，封閉培養(yǎng)皿保濕備用。

1.3.2 種子中β-甘露聚糖酶粗酶液的提取

針對(duì)不同貯存時(shí)間和貯存方式的刺萼龍葵種子，各取培養(yǎng)5 d的種子30粒，用解剖刀將種子的胚（含胚乳，去除種皮）逐一分離，用研缽碾碎并轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加入300 μL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5），于30℃黑暗孵育培養(yǎng)2 h，得到含β-甘露聚糖酶的種子粗酶液。

1.3.3 水解反應(yīng)

分別向制好的培養(yǎng)皿凝膠小孔中加入2 μL含β-甘露聚糖酶的種子粗酶液上清液，以等體積的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5）為對(duì)照，然后用封口膜密封培養(yǎng)皿并將其轉(zhuǎn)移至具蓋白瓷盤(pán)，瓷盤(pán)中放入單層濾紙并加適量的蒸餾水保持濕度（必要時(shí)可補(bǔ)加蒸餾水），密閉瓷盤(pán)，于30℃黑暗條件下保溫、保濕處理20 h。

1.3.4 剛果紅顯色

取出經(jīng)保溫、保濕處理后的培養(yǎng)皿，加入10 mL 0.5%（m/V）的剛果紅染色液，置于水平搖床60 r/min、30℃染色20 min，移出染色液，蒸餾水輕柔洗滌1 min，接著將凝膠用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=7）緩慢振蕩洗滌1～2 min，可清楚地顯示出水解消化圈，然后用80%乙醇洗滌使消化圈邊緣清晰。將顯色凝膠置于掃描儀（EPSON STD 4800）中進(jìn)行圖像掃描，消化圈直徑利用WinSeedle系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)量。

1.3.5 β-甘露聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為建立β-甘露聚糖酶活性與底物消化圈直徑間的定量關(guān)系曲線，將β-甘露聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)品（酶活性46 U/mg，Megazyme公司）用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=5）梯度稀釋至5 000、50 000、100 000、200 000、400 000、800 000、1 600 000倍。分別取2 μL稀釋的標(biāo)準(zhǔn)β-甘露聚糖酶酶液，以稀釋所用的緩沖液為對(duì)照，按1.3.3、1.3.4的步驟進(jìn)行水解和剛果紅顯色反應(yīng)。根據(jù)β-甘露聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)品說(shuō)明及酶活性相關(guān)規(guī)定[16]，酶活性單位U定義為：在一定條件下每分鐘水解底物甘露聚糖形成1 μmol甘露糖時(shí)所需的β-甘露聚糖酶為1個(gè)酶活性單位，即1 U=1 μmol/（min·mg）=1 000 nmol/（min·mg）。β-甘露聚糖酶標(biāo)準(zhǔn)品的活性為46 000 nmol/（min·mg），則梯度稀釋后的酶活性依次為9.2、0.92、0.46、0.23、0.115、0.057 5、0.028 75 nmol/（min·mg）。以水解消化圈的直徑為橫坐標(biāo)，不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)β-甘露聚糖酶的活性為縱坐標(biāo)作圖，擬合方程可得β-甘露聚糖酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合和建立

不同稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)β-甘露聚糖酶可在含專(zhuān)一性底物甘露聚糖的凝膠上水解產(chǎn)生不同大小的透明消化圈，消化圈直徑與酶活性呈顯著的正相關(guān)，酶活性越高消化圈直徑越大，酶活性越低則消化圈直徑越小。對(duì)不同標(biāo)準(zhǔn)β-甘露聚糖酶的梯度酶活性與消化圈直徑進(jìn)行線性擬合，分析比較不同的擬合方程，發(fā)現(xiàn)底物消化圈直徑（x）與酶活性（y）的擬合曲線為指數(shù)方程時(shí)效果最佳，據(jù)此建立了相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.004 1e0.392 6x（R2=0.967） （圖1）。

2.2 刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測(cè)

2.2.1 貯存時(shí)間對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響

應(yīng)用改進(jìn)的凝膠擴(kuò)散法測(cè)定了不同貯存時(shí)間的刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性。結(jié)果表明，種子中β-甘露聚糖酶的活性隨貯存時(shí)間的增加呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，其中貯存5年（2007年）的種子中該酶的活性為0.03 nmol/（min·mg），顯著低于貯存1年（2011年）的種子中酶的活性0.15 nmol/（min·mg）?？傮w來(lái)看，貯存3年以內(nèi)的種子（2009年-2011年）中β-甘露聚糖酶的活性差異不顯著，但均顯著高于貯存3年以上的種子中該酶的活性，說(shuō)明刺萼龍葵種子貯存3年以后，種子中β-甘露聚糖酶的活性開(kāi)始出現(xiàn)顯著降低（圖2）。

2.2.2 貯存條件對(duì)β-甘露聚糖酶活性的影響

對(duì)不同貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，不同處理間種子中β-甘露聚糖酶的活性存在顯著差異。濕潤(rùn)冷藏的種子中該酶活性為0.12 nmol/（min·mg），高于干燥冷藏和干燥室溫貯存的種子中的酶活性，后二者分別為0.02和0.03 nmol/（min·mg）（圖3）。從以上結(jié)果可以看出，貯存條件會(huì)顯著影響刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶的活性，進(jìn)而影響其種子的休眠萌發(fā)特性。

3 討論

已有研究表明，β-甘露聚糖酶與植物種子休眠萌發(fā)密切相關(guān)，在種子細(xì)胞壁的降解和休眠解除方面具有重要作用[5，17-18]。明確β-甘露聚糖酶影響雜草種子休眠和萌發(fā)的機(jī)制，對(duì)雜草發(fā)生和出苗進(jìn)行預(yù)測(cè)和合理調(diào)控，將為雜草的綜合治理提供重要依據(jù)[19]。建立可靠、有效的種子中β-甘露聚糖酶活性檢測(cè)方法，是開(kāi)展相關(guān)研究的關(guān)鍵。

分光光度法（即DNS法）主要利用3，5-二硝基水楊酸與還原糖在堿性條件下的顏色反應(yīng)，對(duì)β-甘露聚糖酶活力進(jìn)行測(cè)定。該方法盡管測(cè)定流程較為簡(jiǎn)單，但由于種子粗酶液中除了β-甘露聚糖酶外，還同時(shí)存在同工酶α-半乳糖苷酶及β-甘露糖苷酶，可以對(duì)β-甘露聚糖酶水解產(chǎn)物進(jìn)一步消化產(chǎn)生還原糖，造成測(cè)定結(jié)果不準(zhǔn)確[3，12，20]。黏度測(cè)定法利用底物消化反應(yīng)前后黏度的變化，對(duì)β-甘露聚糖酶活力進(jìn)行測(cè)定。盡管可檢測(cè)到較低的酶活，但同樣易受β-甘露聚糖酶的同工酶影響，并且樣品逐一檢測(cè)，效率較低[15]。因而上述兩種傳統(tǒng)方法在測(cè)定β-甘露聚糖酶的實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中均受到不同程度的限制。

與傳統(tǒng)方法相比，凝膠擴(kuò)散法采用了剛果紅顯色和專(zhuān)一性底物L(fēng)BG，可降低種子粗酶液中同工酶的干擾，特異性強(qiáng)，降低了實(shí)驗(yàn)誤差。凝膠擴(kuò)散法檢測(cè)靈敏度高，可檢測(cè)稀釋至160萬(wàn)倍的標(biāo)準(zhǔn)酶活力0.029 nmol/（min·mg），且檢測(cè)過(guò)程中重復(fù)性好，可同時(shí)對(duì)大批量種子樣品進(jìn)行酶活性測(cè)定，檢測(cè)成本較低、效率較高。凝膠擴(kuò)散法綜合了傳統(tǒng)分光光度法效率較高和黏度測(cè)定法靈敏度較高的優(yōu)勢(shì)，準(zhǔn)確可靠，具有較好的實(shí)用和推廣價(jià)值。由于種子大小及胚和胚乳成分不同，凝膠擴(kuò)散法是否可用于其他種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測(cè)，不同種子的反應(yīng)體系是否應(yīng)做相應(yīng)調(diào)整，還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究建立了檢測(cè)外來(lái)雜草刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的凝膠擴(kuò)散法，可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)種子樣品，檢測(cè)方法靈敏度高、重復(fù)性好，具有良好的實(shí)用性。該方法的建立為不同貯存時(shí)間和貯存條件下刺萼龍葵種子中β-甘露聚糖酶活性的檢測(cè)提供了技術(shù)支撐，為刺萼龍葵種子休眠水平的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及其種子季節(jié)性休眠機(jī)制的闡明提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 李香菊.近年我國(guó)農(nóng)田雜草防控中的突出問(wèn)題與治理對(duì)策[J].植物保護(hù)，2018，44（5）：77-84.

[2] 強(qiáng)勝.中國(guó)雜草生物學(xué)研究的新進(jìn)展[J].雜草學(xué)報(bào)，2018，36（2）：1-9.

[3] 任艷芳，何俊瑜，王曉峰.植物β-甘露聚糖酶的研究現(xiàn)狀[J].種子，2007，26（4）：44-49.

[4] MORRIS K， LINKIES A， MLLER K， et al. Regulation of seed germination in the close Arabidopsis relative Lepidium sativum： a global tissue-specific transcript analysis [J]. Plant Physiology， 2011， 155： 1851-1870.

[5] HALMER P， BEWLEY J D， THORPE T A.Enzyme to break down lettuce endosperm cell wall during gibberellin-and light-induced germination [J]. Nature， 1975， 258： 716-718.

[6] NONOGAKI H， NOMAGUCHI M， MOROHASHI Y. Endo-β-mannanases in the endosperm of germinated tomato seeds[J]. Plant Physiology， 1995， 94： 328-334.

[7] SANCHEZ R A， SUNELL L， LABAVITCH J M， et al. Changes in the endosperm cell walls of two Datura species before radicle protrusion [J]. Plant Physiology， 1990， 93： 89-97.

[8] 王傲雪，張丙秀，李景富.β-1，4-甘露聚糖內(nèi)切酶在番茄發(fā)育中的作用[J].園藝學(xué)報(bào)，2006，33（5）：1157-1161.

[9] 張蕊，朱虹，周峻沛，等.β-甘露聚糖酶分子生物學(xué)研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2018，20（5）：34-46.

[10] 崔栩，曹云鶴，李瑞國(guó).β-甘露聚糖酶研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志，2010，46（15）：69-72.

[11] 王瑤，王睿琪，那金，等.甘露聚糖酶協(xié)同水解甘露聚糖研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2017，33（21）：21-26.

[12] BOURGAULT R， BEWLEY J D. Gel diffusion assays for endo-β-mannanase and pectin methylesterase can underestimate enzyme activity due to proteolytic degradation： a remedy [J]. Analytical Biochemistry， 2002， 300： 87-93.

[13] DOWNIE B， HILHORST H W M， BEWLEY J D. A new assay for quantifying endo-β-mannanase activity using Congo red dye [J]. Phytochemistry， 1994， 36： 829-835.

[14] STILL D W， DAHAL P， BRADFORD K J. A single-seed assay for endo-β-mannanase activity from tomato endosperm and radicle tissues [J]. Plant Physiology， 1997， 113： 13-20.

[15] 任艷芳.水稻種子萌發(fā)過(guò)程中β-甘露聚糖酶的表達(dá)[D].廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2005.

[16] 王曉丹，郭麗瓊，趙力超，等.木聚糖酶酶活性測(cè)定方法及酶活性單位定義[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2009，35（9）：128-131.

[17] BEWLEY J D. Breaking down the walls—a role for endo-β-mannanase in release from seed dormancy？[J]. Trends in Plant Science， 1997， 2： 464-469.

[18] MO B， BEWLEY J D. The relationship between β-mannosidase and endo-β-mannanase activities in tomato seeds during and following germination： a comparison of seed populations and individual seeds[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（392）： 2503-2510.

[19] 強(qiáng)勝. 我國(guó)雜草學(xué)研究現(xiàn)狀及其發(fā)展策略[J]. 植物保護(hù)， 2010， 36（4）： 1-5.

[20] PINHO G P， MATOSO J R M， SILVERIO F O， et al. A new spectrophotometric method for determining the enzymatic activity of endo-β-mannanase in seeds [J]. Journal of the Brazilian Chemical Society， 2014， 25（7）： 1246-1252.

（責(zé)任編輯： 田 喆）