茭白胡麻葉斑病病原菌分離與鑒定

黃婉琴 李勤 覃章輝

摘要 茭白胡麻葉斑病發生普遍且嚴重，已成為茭白的常見病害。為了明確病原菌，先后從茭白主產區采集胡麻葉斑病病葉，各產區分離純化5～10株病原菌。通過對菌株DNA的內轉錄間隔區ITS基因、3-磷酸甘油醛脫氫酶GPDH基因、延伸因子EF-1α基因的序列進行分析。結合形態學觀察、致病力測定等方法對茭白胡麻葉斑病病菌進行鑒定。結果表明，茭白胡麻葉斑病病原菌為稻平臍蠕孢Bipolaris oryzae，與水稻胡麻葉斑病病原菌一致。本文的研究成果可為茭白胡麻葉斑病的防治提供一種新的思路。

關鍵詞 茭白胡麻葉斑病; 病原菌鑒定; 稻平臍蠕孢

中圖分類號： S 436.45 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019060

Abstract Zizania latifolia leaf spot disease is a common and serious disease. In order to identify the pathogen， we collected infected leaves from different main production areas of Z. latifolia and selected 5 to 10 strains in each area. Identification experiments were performed based on DNA internal transcribed spacer ITS， glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GDPH） and elongation factor EF-1α gene sequences and morphology. The results showed that the pathogen of leaf spot of Z. latifolia was Bipolaris oryzae， which was the same as the pathogen of rice flax leaf spot. This study provides a new idea for the control of leaf spot of Z. latifolia.

Key words Zizania latifolia leaf spot disease; pathogen identification; Bipolaris oryzae

茭白Zizania latifolia，又名高筍、茭瓜，是我國第二大水生蔬菜，也是我國特有蔬菜，經濟效益非常顯著[1]。由Bipolaris oryzae引起的茭白胡麻葉斑病又稱茭白葉枯病，是近年來影響茭白產量的主要病害之一。隨著茭白種植面積逐年擴大，該病的發生范圍也在不斷擴大，在全國茭白主要種植區都普遍發生[2]，而且田間發生程度也越來越嚴重，特別嚴重時，株發病率達90%，病葉率達100%[1]。為了弄清不同茭白主產區胡麻葉斑病病原菌，本研究對茭白五個主產區的胡麻葉斑病菌進行了分離純化、形態學觀察、致病力測定和分子鑒定，以期為茭白胡麻葉斑病的診斷、抗病育種以及病害防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要生物試劑及儀器

DNA提取的相關試劑、藥品購自大連寶生物公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒為愛思進生物技術有限公司產品。本試驗所涉及引物均委托武漢天一輝遠生物技術有限公司合成，使用引物序列詳細信息見表1。

PCR擴增儀（DNA Engine Peltier Thermal cycler，Bio-RAD）;水平電泳儀（DYY-6C，北京）;凝膠成像系統（Gel Doc TMImager，Bio-RAD）;微量分光光度計（Nano Drop 2000c，Thermo Scientific公司）;光學顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i，Nikon Instruments Inc）。

1.2 菌株采集與分離

在2016年7月-2017年11月期間共采樣8次，茭白胡麻葉斑病葉采自湖北武漢市與恩施州，浙江桐鄉縣與金華市，江西九江市，江蘇南通市與揚州市以及廣西貴港市等茭白主產區。病原菌的分離純化方法參照組織分離法[3]，即：取茭白葉片病健交界處，剪切成5 mm×5 mm的小塊，用75%乙醇消毒30 s，滅菌水清洗3次后接種于PDA平板上，每皿4～5塊，置于28℃光照培養箱中暗培養2～4 d，再純化菌株。將成功分離純化的病株用PDA培養基斜面接種保存后，在4℃冰箱中保存（本試驗篩選菌株情況見表2）。

1.3 致病力測定

采用離體葉片接種法[4]，該試驗共進行2次，每次試驗設3個重復。在茭白生長初期取寬約2 cm的葉片進行室內人工接種試驗。從田間采回葉片后剪取其中部約7 cm的一段，置于鋪有濕潤吸水紙的培養皿中，葉背朝上，用直徑為5 mm的菌絲塊進行接種，每皿3組重復加1組PDA培養基瓊脂塊作為空白對照。接種后噴水霧，將培養皿蓋住保濕，置于28℃恒溫黑暗條件下，觀察24～96 h，待葉片出現染病狀態后將菌餅移除，96 h后對病斑進行組織分離，觀察菌落形態以及在顯微鏡下觀察分離到的病菌是否與接種病菌相同。

1.4 菌株形態學特征觀察

將已分離純化的菌株接種在PDA培養基平板上，培養3代后用打孔器沿菌落邊緣切取直徑為5 mm的菌絲塊接種于PDA培養基上，在28℃培養箱中黑暗培養約15 d，期間觀察菌落的顏色以及在PDA培養基上的菌落形態等。在病原菌長滿平板前在顯微鏡下觀察菌絲尖端，待長滿平板后，用無菌水將菌落表面的孢子洗下，在顯微鏡下進行觀察。

1.5 菌株DNA的提取

菌株基因組DNA提取采用CTAB法[5]，核酸溶解后取100 ng產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產物置于-20℃條件下保存備用。

1.6 基因擴增體系及條件

對溶解后的DNA核酸溶液進行質量檢測，然后再進行基因擴增。EF-1α基因擴增體系為25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs （2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加滅菌水至25 μL。反應程序為：95℃預變性5 min;95℃變性30 s ，58℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，循環30次;最后72℃延伸7 min。基因GPDH和基因ITS擴增體系為25 μL，DNA模板1 μg，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各1 μL，Taq酶1 U，加滅菌水至25 μL。基因EF-1α反應程序為：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，54℃退火50 s，72℃延伸1 min，循環40次;最后72℃延伸5 min。基因ITS反應程序為：95℃預變性5 min;95℃變性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環35次;最后72℃延伸7 min。

由于EF-1α基因引物為簡并引物，故將其擴增產物連T載體克隆后送武漢天一輝遠公司測序檢測，其他基因將擴增產物委托公司進行雙向測序。檢測結果分別得到菌株的EF-1α基因序列、ITS基因序列和GPDH基因序列。將測序結果用DNAMAN 7.0軟件進行分析，然后登錄NCBI（National Center for Biotechnology Information）的BLASTn后與GenBank數據庫中公布相關屬種病原菌基因信息作同源性比較分析。

2 結果與分析

2.1 茭白胡麻葉斑病病菌危害癥狀

茭白胡麻葉斑病一般出現在5月下旬到7月上旬之間，在6月下旬到7月中上旬發病速度明顯加快，7月中旬后開始進入發病高峰期，到9月中旬發病速度開始變緩，進入11月后發病逐漸停止[2]。在葉片發病初期，葉片上散生褐色小點，后逐漸擴大成狀如芝麻粒的褐色橢圓形或紡錘形病斑（圖1a）。病斑周圍呈黃褐色暈圈，時有輪紋，后期中心變灰白色。病情嚴重時葉片上分布著密密麻麻的病斑，甚至聯合成不規則的大斑，造成較大的壞死區，致使葉片由葉尖或葉緣向下或向內逐漸枯死，最后葉片干枯。

2.2 形態學鑒定結果

病原菌在PDA培養基上生長良好，初期菌落為灰白色，2～3 d后從中心開始變為淡灰色（圖2a），之后逐漸擴散，28℃黑暗培養7 d后，菌落能長滿直徑為90 mm的培養皿（圖2b）。長滿整個培養皿后菌絲變為褐綠色，最終菌落呈黑褐色，圓環形，菌絲絨毛狀，呈輻射狀展開，邊緣規則，中心部分或有氣生菌絲，或產生白色菌絲團，培養15 d左右氣生菌絲鋪滿整個培養皿。顯微鏡下分生孢子深黃褐色或淺褐色，長卵形、梭形或者倒棍棒形，光滑，正直或一側彎曲，兩端漸狹，鈍圓，4～9個假隔膜，臍部略突出，基部平截，長33～188 μm，寬6～41 μm（圖3）。菌絲尖端疏散鋪開，有向一側彎曲的分支，或短或長（圖4）。

2.3 致病力測定結果與分析

胡麻葉斑病病標樣分離得到的37株菌株接種離體葉片致病力測定結果表明，所有菌株對茭白葉片均能致病，接種后發病率為100%。96 h時，病斑長度增加到3～5 cm左右。人工接種茭白和水稻葉片后，在葉片上表現的癥狀相同（圖1c）。

2.4 茭白胡麻斑病病原菌的分子鑒定

提取所有菌株基因組DNA且酶處理后，在220 V，45 min電泳條件下檢測基因組完整性。部分菌株檢測結果見圖5。

對提取成功的核酸進行含量檢測，每個菌株取1 μg進行特定基因擴增。rDNA-ITS、GPDH和EF-1α基因目的條帶分別約580 bp、550 bp和1 000 bp（圖6）。擴增后的電泳圖目的條帶片段大小跟預測值接近。

測序結果分析發現37株菌株的rDNA-ITS基因序列完全一致，故選取BD73為代表菌株。根據構建的系統發育樹，發現BD73與稻平臍蠕孢MFLUCC10-0694菌株MFLUCC10-0733菌株、MFLUCC13-0511菌株、MFLUCC10-0715菌株、CPC28828菌株、CPC28826菌株聚在一支。同時發現，菌株BD73與這些菌株的rDNA-ITS基因同源相似度在99%。

測序結果分析發現37株菌株的GPDH基因序列完全一致，故選取BD73為代表菌株。根據構建的系統發育樹，發現BD73與稻平臍蠕孢MFLUCC13-0511菌株、BRIP：61686a菌株和平臍蠕孢有性態菌株WKIC聚在一支。同時發現，菌株BD73與菌株MFLUCC13-0511的GPDH基因同源相似度在100%。

37株菌株的EF-1α基因序列有30種不同的序列，將這些序列進行BLASTn比對后，發現這些菌株均與B.oryzae/ATCC44560（99%）、B.oryzae/MFLUCC13-0511（99%）、B.austrostipae /BRIP 12490（99%）、B.zeicola/26-R-13（99%）、B.victoriae/FI3（99%）、B.woodii/BRIP 12239（99%）、A.alternata/UFAH00014（95%）、Alternaria sp./CBS 174.52（96%）、C.cassiicola/624.1相似，且相似度在95%以上。故選以上序列和不同序列的BD73、ES16、M12和TX33為代表菌株，構建NJ樹。根據NJ樹結果，發現BD73、ES16、M12、TX33與稻平臍蠕孢菌株ATCC44560和菌株MFLUCC13-0511在同一支。

3 小結與討論

雖然茭白胡麻葉斑病在茭白葉片上危害程度非常嚴重，但由于茭白的地理分布以及種植分布的局限性。長期以來人們對于茭白胡麻葉斑病的重視程度不夠，導致對該病的研究較少。對于該菌的鑒定傳統方法為觀察病原菌分生孢子，通過測量分生孢子的長度來判斷種類[6-7];長于153 μm即認定為菰平臍蠕孢，小于153 μm則認定為稻平臍蠕孢[8]。后來發現根據形態分類并不準確[9]，稻平臍蠕孢和菰平臍蠕孢的分生孢子大小并沒有明顯的界線將兩者分開。本次對茭白胡麻葉斑病病原菌的形態鑒定也證明了這點。在對所分離的樣本進行形態特征觀察的過程中，采取PDA培養基作為病原菌產孢培養基。發現在PDA培養基上不同菌株產孢量差異較大，有些菌株甚至不產孢，因此很難單從形態學上鑒定是菰平臍蠕孢還是稻平臍蠕孢。關于菌株產孢量與菌株致病力的強弱、菌株不同來源等方面的潛在關系還有待進一步探究。

隨著生物技術的發展，分子分類學的方法開始應用于真菌的鑒定與分類。近些年，已陸續有學者通過rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三個基因對平臍蠕孢屬及其相似屬種進行分類鑒定[10-12]。本研究對茭白胡麻葉斑病病原菌的rDNA-ITS、GPDH、EF-1α三個基因序列分別進行鑒定，將采自湖北、浙江、江蘇、江西和廣西五個主產區的茭白胡麻葉斑病的病原菌鑒定為稻平臍蠕孢Bipolaris oryzae，與水稻胡麻葉斑病病原菌[13]一致。本研究在對該病害病原菌的鑒定、侵染等方面的研究，可以結合水稻胡麻葉斑病的研究成果，為茭白胡麻葉斑病的防治提供新的思路。

參考文獻

[1] 楊紹麗，吳仁鋒.我國水生蔬菜病害研究現狀[J].長江蔬菜，2016（2）：31-34.

[2] 黃懷冬，魏林，梁志懷.茭白胡麻斑病研究進展[J].長江蔬菜，2015（22）：34-36.

[3] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業出版社，1998.

[4] 周而勛，楊媚.廣東省水稻紋枯病菌的致病力和融合群研究[J].廣東農業科學，1999（5）：36-38.

[5] 仇飛.幾種蟲草類真菌多基因分子系統學研究[D].合肥：安徽農業大學，2012.

[6] 楊紹麗，吳仁鋒，劉義滿，等.茭白胡麻葉斑病病原鑒定及其生物學特性[J].長江蔬菜，2012（16）：95-98.

[7] 鄧暉，張天宇.中國平臍蠕孢屬的分類研究I[J].菌物系統，2002，21（3）：327-333.

[8] SIVANESAN A.Graminicolous species of Bipolaris， Curvularia， Drechslera， Exserohilum and their teleomorphs[J]. Mycologia， 1987， 81（1）：170.

[9] MANAMGODA D S， ROSSMAN A Y， CASTLEBURY L A， et al. The genus Bipolaris [J]. Studies in Mycology， 2014， 79（79）：221-288.

[10] XIAO Zilan， HYDE K D， ZHANG Jingze. Synonymy of two species of Bipolaris from aquatic crops of Poaceae [J]. Mycotaxon， 2015， 130（1）：131-143.

[11] 郭玉杰.中國平臍蠕孢屬和彎孢屬真菌分子系統學研究[D].北京：中國農業科學院，2016.

[12] MANAMGODA D S， ROSSMAN A Y， CASTLEBURY L A， et al. The genus Bipolaris [J]. Studies in Mycology， 2014， 79：221-288.

[13] 陳洪亮.水稻胡麻葉斑病病原菌的分離鑒定及生物學特性研究[D].合肥：安徽農業大學，2012.

（責任編輯： 田 喆）