澳洲堅果褐腐病的病原菌鑒定及生物學特性

蔣桂芝 何雙凌 岳海

摘要 對云南景洪發生的澳洲堅果果實褐斑病進行了病原菌分離鑒定和生物學特性研究。經致病性測定、形態學和分子生物學鑒定，病原菌為Calonectria pentaseptata。生物學特性研究表明，該菌菌絲生長的適溫為25～30℃，孢子萌發的適溫為20～25℃，光照對菌絲生長影響不明顯，紫外光對分生孢子的萌發有顯著影響，不同的糖溶液可促進分生孢子的萌發。

關鍵詞 澳洲堅果; 果實腐爛; Calonectria pentaseptata

中圖分類號： S 436.64 ?文獻標識碼： A ?DOI： 10.16688/j.zwbh.2019158

Abstract The pathogen causing macadamia nut brown spot disease in Jinghong， Yunnan province was isolated and identified and their biological characteristics were studied. The pathogen was identified as Calonectria pentaseptata by pathogenicity test， morphology and molecular biology. The study of biological characteristics showed that the suitable temperature for mycelium growth was 25-30℃， and the suitable temperature for spore germination was 20-25℃. The light condition had no obvious effect on mycelium growth. Ultraviolet light had significant effect on conidial germination. Different sugars could promote conidial germination.

Key words macadamia; disease; Calonectria pentaseptata

澳洲堅果Macadamia sp.，又稱夏威夷果、澳洲胡桃等，是世界公認的名貴食用干果和木本油料，被譽為“堅果之王”。據報道，截至2015年我國澳洲堅果種植面積達到12.78萬hm2，占世界種植面積的57.51%[1]。我國澳洲堅果產業起步較晚，至2008年才迅速發展，目前種植較早的果園逐漸進入豐產期，隨著果園種植時間的增加，病蟲害發生日趨嚴重，種類也在不斷變化、增加。2018年6月，在景洪景哈澳洲堅果果園發現未成熟果大量脫落，嚴重的落果達到50%以上。新鮮落果和樹上病果的癥狀表現為：果皮上有褐色病斑，呈水漬狀，病斑邊界清晰，有的病斑上有白色霉狀物（圖1a），與炭疽菌引起的癥狀明顯不同，將此病害暫定為澳洲堅果果實褐斑病。采集癥狀典型的病果帶回實驗室，在室內對病果表面霉狀物進行鏡檢，同時進行病原菌的分離鑒定和病原菌的生物學特性研究，現將結果進行報道。

1 材料和方法

1.1 材料

病原菌分離材料：來源于云南省熱帶作物科學研究所景哈澳洲堅果試驗基地，采集癥狀典型的病果作為病原菌分離標本。

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉17 g，水1 000 mL。

真菌菌絲DNA快速抽提試劑盒、ITS1/ITS4[2]、HIS3[3]、TEF1-α[4-5]、β-tubulin T1/T22[6-7]等PCR擴增引物，由生工生物工程（上海）技術服務有限公司合成。

試驗接種材料：澳洲堅果未成熟果實，由云南省熱帶作物科學研究所澳洲堅果研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 病果上霉狀物鏡檢

用牙簽挑取病果表層霉狀物少許，放在載玻片上，加滅菌水，蓋上玻片，在顯微鏡下觀察霉狀物的形態特征。

1.2.2 病原菌的分離、致病性的測定

病原菌分離：將病果用自來水清潔后，用75%乙醇表面消毒處理30 s后，取病健交界處組織3～4 mm分別放置在PDA培養基平板上25℃下培養5 d，將得到的菌落進行單孢分離，得到純培養菌株用于致病性試驗，并將菌株與病果上鏡檢結果進行比對。

致病性測試：將純培養10 d的菌株孢子制成濃度為1×106個/mL的孢子懸浮液備用。在果園選取20個正常未成熟果，10個作為處理分別用微噴壺在每個果上噴1 mL孢子懸浮液;10個為對照分別接種無菌水1 mL。在20～28℃溫度下，用保鮮袋對果實進行保濕處理，3 d后去除保鮮袋。處理7～10 d，從被感染的果實組織中分離真菌，確認是否為病原菌。

1.2.3 病原菌鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

將純培養病原菌在PDA培養基上培養5～7 d，觀察形態特征、產孢方式等，依據Lombard、Li等[8-9]的方法進行鑒定。

1.2.3.2 分子生物學鑒定

菌株總基因組DNA采用快速抽提試劑盒提取后，分別用4對引物ITS1/ITS4，HIS3，TEF-1α，β-tubulin T1/T22進行PCR擴增， 擴增產物由生工生物工程（上海）技術服務有限公司完成測序，最后將獲得的ITS、HIS3、TEF1-α、TUB2序列上傳至GenBank數據庫，并與GenBank 數據庫中有關序列進行同源性比較，通過MEGA7軟件構建rDNA-ITS-HIS-TEF-TUB序列多基因聯合系統發育樹，確定其分類地位。

1.2.4 生物學特性測定

1.2.4.1 溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

1） 菌絲生長：將純培養菌株用打孔器打成直徑5 mm的菌塊，接種在PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35、40℃，RH 80%，黑暗條件下進行恒溫培養，5 d后采用“十字交叉法”測定菌落生長直徑，每處理4次重復，依據菌落生長情況確定病原菌的適宜溫度。

2） 分生孢子萌發：采用懸滴法，將分生孢子制成2.0×105個/mL的孢子懸浮液，分別在凹玻片凹面滴入500 μL孢子懸浮液，然后凹玻片放入培養皿內保濕，再將培養皿分別置于10、15、20、25、30、35℃，RH 80%的條件10 h，觀察孢子的萌發率，每處理重復3次。

1.2.4.2 光照條件對菌絲生長的影響

將直徑為5 mm 的菌餅接種在PDA 培養基平板后，分別置于連續光照、12 h光暗交替和全黑暗3 種處理，在25℃、RH 80%的培養箱中培養5 d，測定菌落生長直徑，每處理重復3次。

1.2.4.3 紫外光對分生孢子萌發的影響

采用懸滴法，用滅菌水將分生孢子制成2.0×105個/mL的孢子懸浮液，放到無菌凹面載玻片上，然后分別置于40 W紫外燈下50 cm的距離照射0、5、10、15、20、25、30 min，然后在25℃條件下用無菌培養皿保濕，10 h觀察孢子的萌發率。每處理重復3次。

1.2.4.4 糖溶液對分生孢子萌發的影響

用濃度為1%的葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖溶液分別配成2.0×105個/mL孢子懸浮液，然后在凹玻片每個凹面滴入0.5 mL孢子懸浮液，以蒸餾水為對照，在25℃、RH 80%的培養箱中培養10 h，檢查孢子萌發率，每處理重復3 次。

1.2.5 試驗數據處理

試驗數據用SPSS 21軟件處理分析，使用Duncan（D）法。

2 結果與分析

2.1 病果上霉狀物鏡檢

在20倍顯微鏡下觀察，霉狀物為大型分生孢子，圓柱形，兩端圓，（75～100）μm×（6.0～10）μm，有5個隔，未見小型分生孢子。

2.2 病原菌的分離、致病性的測定

分離樣本15個，得到15個菌落。經觀察菌落和分生孢子形態初步鑒定，15個菌落均為同一種真菌，分生孢子形態與病果上霉狀物鏡檢結果一致。單孢分離后，得到純培養菌株編號為OJ20180629。

2018年7月10日進行致病性測定。接種處理3 d除去保鮮袋，接種孢子懸浮液的果實上開始出現點狀水漬病斑，5 d時病斑已擴大變成褐色，病斑邊緣呈水漬狀，7 d時較大的病斑上有裂縫出現，有的病斑上開始出現白色霉狀物，10 d時的癥狀與田間一致（圖1b）;對照無癥狀。從有癥狀的果實中重新分離到與接種一致的真菌，確認菌株OJ20180629對澳洲堅果果實有致病性。

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態鑒定

菌株OJ20180629菌落近圓形，在PDA培養基上生長較慢，25℃時日平均生長量5.95 mm，菌絲絨毛狀，初期為白色，逐漸變為紅棕色，背面紅褐色至深紅棕色（圖2 a）。在PDA培養基上產生大量的分生孢子。大型分生孢子梗由總梗、掃帚狀可育分枝、伸延梗和頂生囊泡組成 （圖2 b）?？偣Ｍ该?，平滑（50～100）μm×（6～9）μm;伸延梗有隔，直或彎曲，長190～420 μm，寬3～7 μm，頂端有隔，終止于棍棒狀的囊泡（圖1 c），直徑2～6 μm。掃帚狀可育分枝上孢子梗長50～96 μm，寬6～9 μm;1級分支0～1隔，（15～30）μm×（3～7）μm;2級分支0～1隔，（16～30）μm×（4～7）μm;3級分支無隔，（14～22）μm×（4～6）μm，每個末端分支產生1～3瓶梗，圓柱形到腎狀的瓶梗，單生時倒梨形，透明，無孔，（14～25）μm×（2～6）μm （圖2 d，e）。大分生孢子圓柱形，兩端圓，（75～101）μm×（6～10）μm，有3～7隔，多數為5隔（圖2 f）， 由無色黏液平行聚集成束?；谶@些形態特征，OJ20180629鑒定為五隔大無性孢麗赤殼菌Calonectria pentaseptata。

2.3.2 分子生物學鑒定

從OJ20180629菌絲體中提取DNA基因組，通過4對引物ITS1/ITS4，HIS3，TEF-1α，β-tubulin T1/T22等進行PCR擴增、測序，獲得531 bp ITS、428 bp HIS3、496 bp TEF-1α、561 bp TUB2片段，登錄號分別為MH794284、MH794286、MH794285、MH794287。在NCBI網站上進行同源性比較，通過BLAST搜索核酸數據庫顯示，與已報道Ca. pentaseptata中的JX855950.1、MF442744.1、MF442859.1和MF443074.1序列相似性分別為99%、100%、100%和100%。通過MEGA7軟件構建菌株OJ20180629的ITS-TEF-TUB多基因聯合與近緣種的系統發育樹，結果顯示OJ20180629與Ca. pentaseptata培養型模式菌株CBS 133349位于同一分枝，支持率為100%（見圖3）。

形態學和分子鑒定分析表明病原菌OJ20180629是Calonectria pentaseptata。

2.4 生物學特性測定

2.4.1 溫度對菌絲生長和孢子萌發的影響

1） 菌絲生長：經過5 d培養，得到不同溫度下菌落的平均生長量，見表1。菌株OJ20180629的菌絲生長溫度范圍為10～35℃，適宜溫度為25～30℃，10℃以下和40℃以上不適宜生長，表明該菌適宜生長溫度范圍廣。

2） 分生孢子萌發：處理10 h 觀察孢子的萌發率結果見表2。表2顯示，菌株OJ20180629孢子萌發的溫度為15～30℃，適宜溫度為20～25℃，25℃時孢子萌發率最高，15℃以下和35℃以上孢子不能萌發。

2.4.2 光照條件對菌絲生長的影響

培養7 d，菌落生長情況見表3。全光照、12 h光、暗交替、全暗等3種處理間無極顯著差異，即光照條件對菌絲生長影響不明顯。

2.4.3 紫外光對分生孢子萌發的影響

處理后10 h觀察孢子的萌發結果見表4。紫外光對分生孢子的萌發有顯著影響，隨著紫外光照時間的延長，分生孢子的萌發率顯著降低，紫外光照至20 min以上時分生孢子不能萌發，說明分生孢子對紫外光較敏感。

2.4.4 糖溶液對分生孢子的萌發影響

在25℃、RH 80%的培養箱中培養10 h，分生孢子的萌發率見表5。1%糖溶液可以提高分生孢子的萌發率，即可促進分生孢子的萌發，其中以葡萄糖的促進效果最好，以后依次為麥芽糖、蔗糖、乳糖、果糖。

3 討論

由五隔大無性孢麗赤殼菌Ca. pentaseptata引起澳洲堅果果實褐斑病屬首次報道。由Ca. pentaseptata引起植物病害的報道不多見，目前報道在桉樹、澳洲堅果[10]和紅千層、千層金[11]等植物葉片上分離到，是桉樹焦枯病的病原菌之一。對Ca. pentaseptata生物學特性的研究表明，該菌菌絲的生長溫度范圍廣，為10～35℃，孢子萌發的溫度為15～30℃，光照條件對菌絲生長影響不明顯，但紫外光對分生孢子的萌發有顯著影響，糖可促進分生孢子的萌發。在調查病害時發現，果園蔭蔽度大，濕度大，陽光很少能直射到地面，并且果實蟲蛀率在5%～10%左右，基于果園內的環境條件和病原菌的生物學特性，建議對澳洲堅果褐斑病的防治首先應采用農業措施——修枝整形，降低果園的蔭蔽度，讓紫外光穿過樹冠照進果樹內堂，同時降低果園內濕度，可抑制病原菌孢子的萌發;其次，對病害進行監測，在出現利于病害發生的天氣條件時先進行預防噴施保護劑，必要時再使用殺菌劑進行防治。

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（責任編輯： 田 喆）